LC-MS analyse av humane blodplater som en plattform for å studere mitokondrie Metabolism

Summary

Her viser vi isolerte humane blodplater kan anvendes som en rullestol ex vivo modell for å studere metabolske tilpasninger som reaksjon på det komplekse I-inhibitor rotenon. Denne tilnærmingen benytter isotopisk sporing og relativ kvantifisering ved væske-kromatografi-massespektrometri og kan brukes på en rekke forskjellige studiedesign.

Abstract

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Introduction

Dysfunksjonell mitokondrielle metabolismen har vært implisert i en rekke sykdommer, inkludert nevrodegenerasjon, kreft, kardiovaskulær sykdom og ^30. Som sådan har stor innsats er lagt vekt på å karakterisere metabolske defekter som bidrar til sykdom patogenesen. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) er regnet som gullstandarden for kvantifisering av analytter fra komplekse biologiske matriser og er ofte brukt for metabolske studier ^8. Imidlertid, som det ofte er tilfelle med biomedisinske studier, å oppnå en tilgjengelig og godt definert modell som er relevante for human sykdom er en utfordring.

Mange studier ansetter transformert cellemodeller for undersøkelser av virkningen av xenobiotics eller genetiske avvik på cellenes stoffskifte ^7,9. Den metabolske omprogrammering som oppstår i kreftceller kan innføre forstyrrende faktorer ²¹ og er derfor ikke ideelt. Disse problemene kan være circumvented med primære cellemodeller, selv om å skaffe tilstrekkelig biomasse til metabolske analyser kan være utfordrende. Videre er effekten av store mengder antibiotika som brukes i kulturen blitt markert som potensielt konfunderende mitokondrielle studier ^16.

Humane blodplater, hvilket gir mulighet til å utnytte en primær celle modell med tilstrekkelig mitokondrie-innhold for metaboliske studier ^5,22,27,32. Først kan blodplater være lett kjøpt gjennom blod trekker fra individuelle givere, eller i store volumer fra blodbanker, og derfor gi en modell hvor ytre faktorer kan lett kontrolleres. For det andre, på grunn av sin lille størrelse, blodplater kan lett isoleres fra andre blodkomponenter med minimal forberedende arbeid i og med minimalt utstyrte laboratorier ^5. Av notatet, blodplater ikke inneholde kjerner og kan derfor brukes til å studere endringer i metabolismen uavhengig av transkripsjonsregulering. Her viser vi ati tillegg til relativ kvantifisering av acyl-koenzym A (CoA) tioestere, kan det isolerte blodplate-systemet bli brukt til å undersøke karbon metabolisme. Spesielt rapporterer vi bruk av metabolsk merking med stabile isotoper (ikke-radioaktive) merket ^[13 C _6] -glukose og ^[13 C _16] -palmitate å sondere inkorporering av ^[13 C] label inn den viktige metabolitten acetyl CoA via glykolyse eller fettsyre oksidasjon. Dette gir en kraftig, generaliseres, og allsidig plattform på grunn av den omfattende involvering av acyl-CoA arter i biokjemiske pathways ^13,24 og tractability av dette systemet til å teste andre variabler, for eksempel hemming av komplekse jeg med rotenon ^3,33. I tillegg til informasjon gitt i protokollen under kan en omfattende beskrivelse av metodene som brukes for isotop merking og for LC-MS-baserte analyser finnes i Basu og Blair ^4.

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle protokoller vedrørende behandling av humane prøver følge retningslinjene i The University of Pennsylvania menneskelige forskningsetisk komité. 1. Utarbeidelse av buffere og 100x Stock Solutions Forbered en L base Tyrode buffer. Kombiner 8,123 g NaCl, 1,428 g NaHCO3, 0,466 g CaCl 2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 g KCl, og 0,095 g MgCl 2. Juster totale volumet til en L med DDH 2 O. Filter sterilisere basen Tyrode b…

Representative Results

For å demonstrere nytten av denne metodikken vi har gjengitt enes allmenn tidligere beskrevet kompenserende metabolske tilpasninger som følge av eksponering for rotenon. Dette funnet var tidligere identifisert i cellekultur modeller og denne undersøkelsen var rettet for å teste om dette metabolske forskyvning også forekommer i blodplater, som er anuclear og ikke er utsatt for de samme eksperimentelle gjenstander som cellekultur. Dette arbeidet ble utført med seks dager gamle blodpl…

Discussion

Her har vi vist nytten av isolerte blodplater som en plattform for å studere opprørt mitokondrie metabolisme. Nærmere bestemt har vi karakterisert metabolsk tilpasning i respons til kompleks I hemming av rotenon.

Denne studien har forlenget tidligere rapporterte funnene på seg rollen som kompleks I hemming av rotenon i cellelinjer til humane blodplater. Viktigere, og dette viste at rotenon også hemmet blodplate-succinyl-CoA formasjon, stimuleres en økning i blodplate βHB-CoA, og hadde…

Materials

Reagent
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	746398
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O)	Sigma-Aldrich	223506
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
13C6-Glucose	Sigma-Aldrich	389374
Palmitic acid	Cayman	10006627
13C16-Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	605573
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Trichloro Acetic Acid	Sigma-Aldrich	T6399
5-Sulfosalicylic Acid	Sigma-Aldrich	390275
Acetonitirle	Fischer Scientific	A996-4	(optima)
Water (H2O)	Fischer Scientific	W7-4	(optima)
Formic acid	Fischer Scientific	85171	(optima)
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Fischer Scientific	04-355-222
Methanol	Fischer Scientific	A454-4	(optima)
Ammonium Acetate	Fischer Scientific	A639-500
2 mL Eppendorf Tubes	BioExpress	C-3229-1
LC vials (plastic)	Waters	186002640
10 mL Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns	Waters	WAT094225
Pastuer Pipets	Fischer Scientific	13-678-200
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
CO2 Water-Jacketed Incubator	Nuaire	AutoFlow NU-8500
Triple Quadropole Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Finnigan TSQ Quantum
HPLC	Thermo Scientific	Dionex Ultimate 3000
Source	Thermo Scientific	HESI II
HPLC Column	Phenomenex	Luna C18	3 μm particle size, 200 mm x 2 mm