माउस कोरोनरी endothelial कोशिकाओं के अलगाव
Summary
This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Abstract
Endothelial कोशिकाओं से रक्त वाहिकाओं की भीतरी दीवार लाइन और संवहनी टोन, संवहनी पारगम्यता, और नए संवहनी गठन के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। Endothelial सेल रोग के विकास और इस्कीमिक हृदय रोग सहित कई हृदय रोगों की प्रगति में फंसा है। समारोह और कोरोनरी endothelial कोशिकाओं के लक्षण वर्णन की जांच करने के लिए, सेल अलगाव पहला कदम है और यह बाद के प्रयोगों का संचालन करने के लिए उच्च शुद्धता और मात्रा की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल वयस्क माउस कोरोनरी endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक कारगर तरीका बताता है। माउस दिल विच्छेदित और छोटे टुकड़ों में कीमा बनाया हुआ है। दिल Dispase और collagenase द्वितीय का उपयोग कर के पाचन के बाद, कोशिकाओं धोया और चुंबकीय मोती जो विरोधी CD31 एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित हैं साथ incubated हैं। endothelial कोशिकाओं के साथ मोती धोया कई बार कर रहे हैं और इमेजिंग और आणविक जैविक experime सहित विभिन्न अनुप्रयोगों में उपयोग करने के लिए तैयार हैंएनटीएस। कुशल अलगाव 90% से अधिक शुद्धता के साथ एक दिल के अनुसार लगभग 10 4 कोशिकाओं पैदावार।
Introduction
विभिन्न हृदय रोगों और चयापचय विकारों के माउस मॉडल शारीरिक और आणविक परिवर्तन जो रोगियों में पाए जाने वाले के समान हैं सहन। इसके अलावा, चूहों के आनुवंशिक परिवर्तन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है कि हमें विकास और रोगों की प्रगति में विशिष्ट जीन की रोगजनक भूमिका की जांच करने की अनुमति देता है। आजकल, सेल प्रकार विशिष्ट जीन-दस्तक में या आउट चूहों को आसानी से कई प्रयोगशालाओं और mRNA की माप और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में प्रोटीन के स्तर में उत्पन्न कर रहे हैं कि क्या निर्धारित चूहों वास्तव में आनुवंशिक रूप से संशोधित किया गया है में पहला कदम है।
अन्तःस्तर endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) है कि लाइनों भीतरी दीवार नाड़ी की एक पतली परत भी है। Endothelial कोशिकाओं नाड़ी तनाव, संवहनी पारगम्यता, और नए संवहनी गठन 1,2 विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। Endothelial रोग कई रोग की स्थिति और endothelial समारोह में परिवर्तन की एक बानगी विभिन्न कार को जन्म दे सकता हैdiovascular रोगों 3,4। यह शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत endothelial कोशिकाओं के समारोह में अध्ययन करने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है।
वहाँ ईसीएस 5-8 अलग-थलग करने के कई तरीके हैं और अलगाव विधि के आधार पर जो ऊतकों और प्रजातियों का इस्तेमाल किया जाएगा अनुकूलित किया जाना है। क्योंकि विभिन्न ऊतकों से ईसीएस उनकी सतह मार्करों के लिए सम्मान और प्रोटीन अभिव्यक्ति 9 के साथ विविधता के उच्च स्तर को प्रदर्शित यह वह जगह है। endothelial कोशिकाओं के सफल अलगाव अक्सर चुनौतीपूर्ण हो सकता है और प्रशिक्षण और अभ्यास के कुछ डिग्री की आवश्यकता है। एक बार हासिल की है, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित अलगाव की विधि स्थिर और कुशल साबित होता है।
इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए उच्च गुणवत्ता और मात्रा के प्राप्त करने के लिए माउस कोरोनरी ईसीएस (MCECs) है। हालांकि एक दिल से एकत्र कोशिकाओं की मात्रा अन्य तकनीकों का उपयोग अन्य ऊतकों से एकत्र कोशिकाओं की तुलना में कम है, इस तकनीक को अभी भी शर्त प्रदान करता हैआतंकवाद गुणवत्ता। जिसके परिणामस्वरूप जनसंख्या में endothelial कोशिकाओं की शुद्धता 90% से अधिक है। इस प्रकार, इस तकनीक अनुप्रयोगों है कि इस तरह के सेल इमेजिंग के रूप में विशुद्ध रूप से अलग-थलग endothelial कोशिकाओं पर भरोसा करने के लिए आदर्श होगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया endothelial कोशिकाओं को अपनी सुविधा और संवर्धन की आसानी के कारण मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) कर रहे हैं। हालांकि, अनुसंधान के एक बहुत अन्य विशिष्ट अंग?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य (ए Makino को HL115578) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
| Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | BD | 356006 | Corning |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |
References
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
