The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.
सिगरेट के धुएं (सीएस) हृदय और फेफड़ों के रोगों के लिए एक बड़ा जोखिम कारक है। क्योंकि सीएस एक जटिल एयरोसोल 7,000 से अधिक रसायन युक्त 1 यह अपने समग्र विषाक्तता के लिए अलग-अलग घटकों के योगदान का आकलन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है। अलग-अलग घटक के रूप में अच्छी तरह से मिश्रण की विषाक्तता प्रोफाइल हालांकि, इन विट्रो में स्थापित किया जा सकता है, के माध्यम से डाल स्क्रीनिंग उपकरण है, जो तंबाकू के धुएं के हानिकारक और हानिकारक घटक (HPHCs) की रूपरेखा सक्षम उच्च लगाने से के रूप में अमेरिका के खाद्य एवं औषधि द्वारा परिभाषित प्रशासन (एफडीए)। 2
एक प्रारंभिक आकलन के लिए, एक प्रतिबाधा आधारित साधन यौगिक की विषाक्तता के एक वास्तविक समय, लेबल मुक्त मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया था। साधन readout कोशिका आसंजन, व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान है कि सभी एक साथ सेल स्थिति का अवलोकन प्रदान पर निर्भर करता है। एक आयामरहित पैरामीटर, सेल सूचकांक का नाम, मात्रा का ठहराव के लिए प्रयोग किया जाता है। अलग का एक सेटअलग धुंधला प्रोटोकॉल एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग आधारित जांच के लिए विकसित किया गया था और एक एचसीएस मंच प्रत्येक HPHC द्वारा हासिल cytotoxicity के प्रकार पर अधिक गहराई से जानकारी हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
15 घटक का परीक्षण में से सिर्फ पांच एचसीएस आधारित विश्लेषण के लिए चयन किया गया था के रूप में वे एक गणनीय एलडी 50 (<20 मिमी) दर्ज की गई। इनमें 1-aminonaphtalene, आर्सेनिक (वी), क्रोमियम (छठे), Crotonaldehyde और Phenol। एचसीएस में उनके प्रभाव के आधार पर, 1-aminonaphtalene और Phenol क्रोमियम (छठे) में वृद्धि हुई हिस्टोन H2AX फोस्फोराइलेशन पर आधारित genotoxic के रूप में साथ mitochondrial रोग को उत्पन्न करने के लिए की पहचान की जा सकता है, और एक साथ। Crotonaldehyde एक ऑक्सीडेटिव तनाव inducer और आर्सेनिक एक तनाव काइनेज मार्ग उत्प्रेरक के रूप में के रूप में पहचान की थी।
यह अध्ययन दर्शाता है कि प्रतिबाधा आधारित और एचसीएस प्रौद्योगिकियों के संयोजन सीएस घटक की इन विट्रो मूल्यांकन के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है।
Toxicological जोखिम मूल्यांकन ऐतिहासिक पशु मॉडल का उपयोग करें, जो, हालांकि जीवन विज्ञान के क्षेत्र में मौलिक, भी इस तरह के मानव और उच्च लागत के लिए असंगत translatability के रूप में कमियों के साथ जुड़े हुए हैं पर भरोसा किया है। इसके अलावा, वहाँ एक बढ़ती हुई की "3Rs" 2 (प्रतिस्थापन, कमी, और शोधन) भावना में पशु परीक्षण के लिए विकल्प खोजने का प्रयास किया गया। इस प्रयास, पिछले कुछ वर्षों में त्वरित किया गया है ही नहीं, क्योंकि इस तरह के उच्च throughput तकनीक और प्रणालियों जीव विज्ञान के दृष्टिकोण, लेकिन यह भी पशु परीक्षण के उपयोग को सीमित करने के विधान के कारण के रूप में हाल के अग्रिमों, विशेष रूप से यूरोपीय संघ में की।
विषाक्त अपमान के जवाब को विनियमित सेलुलर संकेत दे रास्ते की जटिलता यह स्पष्ट है कि एकल विषाक्तता समापन का उपयोग कर कुछ यौगिकों की विषाक्तता आधार वर्णन करने के लिए पर्याप्त नहीं होगा बनाता है। इस के लिए, बातचीत पी के सैकड़ों की परस्पर क्रियाएक जैविक नेटवर्क के लिए योगदान दे roteins भी ध्यान में रखा जाना करने की आवश्यकता होगी। उन नेटवर्कों पर विषैले पदार्थ के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, एक प्रणाली विष विज्ञान प्ररूपी मध्यम और उच्च throughput स्क्रीनिंग assays के साथ संयुक्त दृष्टिकोण शक्ति अनुमान करने के लिए और एक ही समय में अलग-अलग विषैले पदार्थ की कार्रवाई की व्यवस्था के बारे में अधिक जानकारी उपलब्ध कराने के लिए उपयोगी है।
इस अध्ययन में, हम एक शक्तिशाली स्क्रीनिंग उपकरण है, जो एक स्वचालित माइक्रोस्कोप और एक जैविक सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग से बना है, कि प्राप्त कर सकते हैं, प्रक्रिया और विशिष्ट प्रतिदीप्ति आधारित सेलुलर assays से ली गई छवि डेटा का विश्लेषण के रूप में एचसीएस कार्यरत हैं। यह 3 उदाहरण के लिए एक एकल कोशिका या subcellular स्तर पर, मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए एक सेल के भीतर दृश्य परिवर्तन के लिए अनुमति देता है, और कई मापदंडों एक साथ विश्लेषण किया जा सके।, डीएनए डबल कतरा टूटता हिस्टोन H2AX फोस्फोराइलेशन की एक एंटीबॉडी आधारित पहचान का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) एक सेल पर्म का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया गयाeable सुपरऑक्साइड संवेदनशील डाई।
क्योंकि फेफड़ों उपकला कोशिकाओं सिगरेट का धुआँ सहित साँस विषैले पदार्थ, के खिलाफ पहला जैविक बाधा प्रतिनिधित्व करते हैं, हम संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा प्रकाशित HPHCs के प्रभाव प्रोफ़ाइल करने के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में प्राथमिक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं का उपयोग किया। 4 यह पांडुलिपि एक अनुवर्ती है पिछले एक अध्ययन 5 जिसमें हम HPHCs का एक अलग सबसेट का जैविक प्रभाव का मूल्यांकन पर मेकअप।
हमारे कार्यप्रवाह इन विट्रो में cytotoxicity का आकलन करने के हिस्से के रूप में, हम शुरू में 15 HPHC के एक चयन की शक्ति का मूल्यांकन, एक प्रतिबाधा आधारित वास्तविक समय सेलुलर विश्लेषण (RTCA) प्रणाली है जो हमें खुराक पर्वतमाला, बाद में HCS के लिए उपयुक्त स्थापित करने के लिए अनुमति का उपयोग कर विश्लेषण (चित्रा 1)। एक विषाक्तता एचसीएस आकलन तो सेलुलर विषाक्तता के नौ मल्टी पैरामीट्रिक समापन का उपयोग किया गया था, जिनमें से प्रत्येक दो समय अंक (4 और 24 घंटे) पर नजर रखी। तालिका 1 में वर्णित के रूप में, 7 गतिविधि, साइटोक्रोम सी जारी है और कोशिका झिल्ली पारगम्यता – इस्तेमाल किया मार्करों mitochondrial विषाक्तता, डीएनए की क्षति, तनाव काइनेज, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), glutathione (GSH) सामग्री, कस्पासे 3 की सूचक थी।
हमारा दृष्टिकोण सक्षम पहचान और खुराक और समय पर निर्भर नमूने के माध्यम से सिगरेट के धुएं के घटक दलों के प्रभाव की विशेषता। अंत में, यह प्रत्येक HPHC के लिए इन विट्रो विषाक्तता प्रोफ़ाइल का उत्पादन किया। मल्टी omics दृष्टिकोण भी आगे एचसीएस विश्लेषण पूरक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह अंत में भी सेल संकेतन और / या ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर प्रभाव की एक गहरी समझ प्रदान करेगा।
पशु प्रयोग करने के लिए विकल्प के लिए और नए उच्च throughput परीक्षण के दृष्टिकोण के लिए जरूरतों को व्यापक रूप से पिछले वर्षों में चर्चा की गई है। यह वैज्ञानिकों और नियामक अधिकारियों मानक विषाक्तता परीक्षण के लिए वैकल्पिक तरीकों, सेलुलर assays कि निकट लक्ष्य ऊतकों के शरीर क्रिया विज्ञान की नकल के उपयोग की जांच करने के लिए प्रेरित किया है। इस अध्ययन में, हम एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) मंच के साथ एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक (RTCA) के संयोजन मानव फेफड़ों उपकला कोशिकाओं पर ही सीएस घटक के लिए जोखिम के प्रभाव का आकलन करने के लागू प्रदर्शन किया है। इस सेटअप तुलनात्मक रूप से विभिन्न अन्य हवाई प्रदूषण, हवाई कणों, और नैनोकणों से प्रेरित cytotoxicity का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, प्राप्त परिणामों के कारण जैविक नेटवर्क के आधार पर पूरे जीनोम transcriptomics और कम्प्यूटेशनल विधियों से उन लोगों के साथ मिलान किया जा सकता है। जैसा कि पहले बताया, इस दृष्टिकोण आणविक मार्ग पर डेटा की पुष्टि करने के लिए हमें की अनुमति दीसीएस जोखिम 5 एचसीएस समापन के साथ पर गड़बड़ी, ये मार्ग perturbations को संबोधित भी phenotypically।
एक फ़्लोचार्ट परख के रूप में, वास्तविक समय सेल विश्लेषण एक खुराक और समय पर निर्भर संकल्प है, जो बेहतर निर्णय लेने के जो खुराक और जोखिम समय बिंदु बहाव के विश्लेषण 14 के लिए अनुकूल हो सकता है की अनुमति देता में सेल व्यवहार्यता से संबंधित जानकारी प्रदान करता है। विश्लेषक के सिद्धांत कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न के रूप में वे देते हैं और एक संस्कृति में अच्छी तरह से सतह एक सोने microelectrode के साथ कवर पर फैल विद्युत प्रतिबाधा में बदलाव पर निर्भर करता है। प्रतिबाधा सेल सूचकांक नाम के एक आयामरहित पैरामीटर, जो कोशिका आसंजन की निगरानी के लिए, प्रसार, आकृति विज्ञान और अंततः सेल व्यवहार्यता का इस्तेमाल किया जा सकता है में बदल जाती है। हालांकि इस तकनीक साइटोटोक्सिक तंत्र के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है, इसकी संवेदनशीलता भी बहुत कम मात्रा है, जिस पर एचसीएस जानकारीपूर्ण नहीं है पर रूपात्मक सेलुलर परिवर्तन का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है (डेटा) नहीं दिखाया। previ के आधार परous प्रयोगों, हम उल्लेख किया है कि RTCA कार्यप्रणाली एचसीएस समापन की तुलना में कम मात्रा में रूपात्मक परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम है।
वास्तविक समय सेल विश्लेषक के साथ प्रारंभिक जांच के बाद, एक एचसीएस मंच प्रत्येक HPHC द्वारा हासिल cytotoxicity के प्रकार पर अधिक गहराई से जानकारी हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एचसीएस परख पैनल सेलुलर डिब्बों पर उनके संभावित प्रभाव की ओर HPHCs प्रोफ़ाइल करने के लिए अनुमति / अंगों के रूप में अच्छी तरह से genotoxicity या ऑक्सीडेटिव तनाव जानने उन की पहचान। विश्लेषण अलग प्रोफाइल जिससे चुने गए HPHCs NHBE कोशिकाओं में cytotoxicity प्रेरित का पता चला। सामान्य में, सभी यौगिकों, फिनोल, सिवाय उच्चतम परीक्षण किया खुराक पर नेक्रोसिस प्रेरित करने के लिए पाए गए। genotoxicity के लिए एक मार्कर के रूप H2AX के कैंसर के विकास 1-aminonaphtalene प्रेरित फोस्फोराइलेशन में एक संभावित भूमिका है, तथापि एचसीएस पैनल mitochondrial विषाक्तता readout में इस HPHC का भी खुला गतिविधि (बड़े पैमाने पर वृद्धि हुई है और साइटोक्रोम सी relea के अनुरूपएसई) और oxidative तनाव (GSH कमी)। इसी तरह, के रूप में पहले से वर्णित, फिनोल mitochondrial रोग को उत्पन्न, और डीएनए की क्षति के साथ ही GSH कमी पैदा करने के लिए पहचान की गई थी। क्रोमियम (छठे), यौगिकों के समूह मैं कार्सिनोजन के रूप में वर्गीकृत में से एक है, और Crotonaldehyde भी दोनों के रूप में genotoxic की पहचान की गई है, विशेष रूप क्रोमियम (छठे) भी प्रेरित apoptosis (कस्पासे झरना सक्रियण) और Crotonaldehyde में हुई वृद्धि हुई आरओएस पीढ़ी। अंत में आर्सेनिक (वी), cJun फोस्फोराइलेशन जो तनाव काइनेज मार्ग सक्रियण के एक मार्कर है प्रेरित करने के लिए मिला था।
इस अध्ययन में, हम इन विट्रो में फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं के लिए एक मॉडल के रूप में NHBE कोशिकाओं का उपयोग किया। एक एचसीएस की स्थापना में इन कोशिकाओं का उपयोग करते हुए अभूतपूर्व है और genotoxicity और oxidative तनाव मार्कर सहित समापन, का एक व्यापक रेंज की जांच सक्षम होना चाहिए। दोनों रहते सेल और निश्चित सेल धुंधला दृष्टिकोण हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है, समग्र तकनीक के लचीलेपन का प्रदर्शन है। एफ मेंअधिनियम, बहुत ही प्रोटोकॉल के लक्ष्यों का एक व्यापक रेंज है, जो किसी भी फ्लोरोसेंट डाई या एंटीबॉडी के उपयोग के द्वारा संबोधित किया जा सकता करने के लिए लागू किया जा सकता है। लाइव धुंधला प्रोटोकॉल के सफल क्रियान्वयन के लिए, यह ऊष्मायन समय का सम्मान करने के लिए, के रूप में रंगों के कुछ एक सीमित आधा जीवन और प्रतिदीप्ति संकेत छवि अधिग्रहण के पूर्ण होने से पहले कम हो सकती है महत्वपूर्ण है। यह भी विचार है कि यदि एक अलग सेल प्रकार प्रयोग किया जाता है, सब धुंधला शर्तों इष्टतम डाई एकाग्रता के रूप में फिर से मूल्यांकन किया जाना चाहिए, और ऊष्मायन समय अलग हो सकता है महत्वपूर्ण है।
वर्तमान पत्र में हम एक परिदृश्य में जहां केवल पांच यौगिकों जहां एचसीएस कार्यप्रणाली के साथ जांच का वर्णन किया है। पहले से वर्णित थाली लेआउट को ध्यान में रखते, वे, 24 प्लेट (6 assays और 2 समय अंक) प्लेटों की व्याप्ति संख्या में भी वृद्धि हुई किया जा सकता है की एक कुल के लिए 2 से अधिक विभिन्न प्लेट सेट dosed थे जिससे अधिक यौगिकों या के एक साथ प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है जांचअधिक समापन के tigation। ऐसा करने से पहले, तथापि, एक ध्यान में रखना चाहिए कि कुछ समापन (GSH और आरओएस) तत्काल अधिग्रहण की आवश्यकता होती है, और एक परिणाम के रूप में, प्लेटों की खुराक पिछले प्लेट के अधिग्रहण की अनुमति के लिए एक कंपित फैशन में किया जाना चाहिए। के रूप में प्लेटें एक बाद में मंच पर, खड़ी की जा सकती निर्धारण के बाद किसी भी कदम पर प्रोटोकॉल दखल, धुंधला प्रक्रिया के पूरा होने के लिए दूसरी ओर, एक निश्चित सेल धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है। यह दृष्टिकोण, उदाहरण के लिए, समय डेटा की गुणवत्ता से समझौता किए बिना सभी को लाइव सेल धुंधला प्लेटों को पूरा करने के साथ ऑपरेटर प्रदान करेगा।
आगे प्लेटों की संख्या कम करके कार्यप्रवाह अनुकूलन करने के लिए, यह भी अधिक समापन एक साथ मल्टीप्लेक्स के लिए संभव हो जाएगा। इस संदर्भ डीएनए में नुकसान और तनाव में उदाहरण के लिए Kinase एक साथ जांच की जा सकता विभिन्न ग में उत्सर्जन fluorochromes के साथ बस दो माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोगhannels। एचसीएस मंच के सतत विकास, पूरी तरह से स्वचालित सेल बोने, यौगिक कमजोर पड़ने, खुराक और धुंधला सहित, साथ ही नए समापन के अलावा आगे अन्य प्रकार की कोशिकाओं उपकला पर HPHCs और के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में की रूपरेखा एचसीएस मंच की क्षमता का विस्तार होगा ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों पांडुलिपि की उनकी समीक्षा के लिए Kårsta Luettich और ग्रेगरी Vuillaume को धन्यवाद देना चाहूंगा।
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
Screener (HCS) | Genedata | NA | |
CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
Easy Flask filter cap 75cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
10X permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
10X blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |