This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.
Óptica de super-resolución de imagen con iluminación estructurada microscopía (SIM) es una tecnología clave para la visualización de los procesos a nivel molecular de las ciencias biomédicas y químicas. Aunque los sistemas de SIM comerciales están disponibles, los sistemas que están diseñados a medida en el laboratorio puede superar los sistemas comerciales, este último típicamente diseñados para facilidad de uso y aplicaciones de uso general, tanto en términos de la fidelidad de imagen y velocidad. Este artículo presenta una guía detallada para la construcción de un sistema de SIM que utiliza la iluminación de reflexión interna total (TIR) y es capaz de imágenes de hasta 10 Hz en tres colores con una resolución de llegar a 100 nm. Debido a la combinación de SIM y TIRF, el sistema proporciona un mejor contraste de la imagen que las tecnologías rivales. Para cumplir con estas especificaciones, varios elementos ópticos se utilizan para habilitar el control automatizado sobre la estructura y estado de polarización espacial de la luz de iluminación para todos wav excitación está disponibleelengths. se dan detalles sobre la ejecución y control de hardware para lograr la sincronización entre la generación de luz de excitación patrón, longitud de onda, estado de polarización, y el control de la cámara con un énfasis en lograr la máxima velocidad de fotogramas de adquisición. Un protocolo paso a paso para la alineación y calibración del sistema se presenta y la mejora alcanzable resolución se valida en muestras de ensayo ideales. La capacidad para la velocidad de vídeo de super-resolución de imagen se demuestra con las células vivas.
Durante la última media década, super-resolución de la microscopía ha madurado y se trasladó de los laboratorios de óptica especialistas en manos de los biólogos. Existen soluciones comerciales de microscopio para las tres variantes principales para lograr la óptica de super-resolución: sola molécula de microscopía de localización (SMLM), estimuló la microscopía agotamiento de emisión (STED), y estructurado iluminación microscopía (SIM) 1,2. SMLM como la microscopía photoactivated localización (PALM) y estocástico microscopía óptica de reconstrucción (Storm) han sido las técnicas más populares, en gran parte debido a la simplicidad de la configuración óptica y la promesa de alta resolución espacial, con facilidad hasta 20 nm. Sin embargo super-resolución microscopía vía única localización molécula viene con una compensación intrínseca: la resolución alcanzable espacial depende de la acumulación de un número suficiente de localizaciones de fluoróforos individuales, por lo tanto, la limitación de la resolución temporal. proceso dinámico de imágenesES en células vivas, por tanto, se convierte en problemático, ya que hay que muestrear adecuadamente el movimiento de la estructura de interés para evitar artefactos de movimiento mientras que también adquirir suficientes eventos de localización en ese momento para reconstruir una imagen. Con el fin de cumplir con estos requisitos, demostraciones en vivo de células SMLM han obtenido el incremento requerido en las tasas de fluoróforo photoswitching aumentando en gran medida la potencia de excitación, y esto a su vez conduce a la fototoxicidad y el estrés oxidativo, lo que limita el tiempo de supervivencia de la muestra y relevancia biológica 3.
Una clara ventaja de STED sobre ambos SIM y SMLM es que puede se logró imagen con super-resolución en muestras gruesas, por ejemplo la resolución lateral de alrededor de 60 nm en cortes de cerebro organotípicos a profundidades de hasta 120 micras 4. Imaging a tales profundidades con implementaciones objetivos individuales de SMLM o SIM es inviable, sino que se hace posible con cualquiera de lámina de luz de una sola molécula o celosía de lámina de luz micrófonoroscopy 5. -STED velocidad de vídeo también se ha demostrado y se utiliza para mapear la movilidad de las vesículas sinápticas, aunque hasta ahora esto se ha limitado a la formación de imágenes pequeños campos de visión 6.
Para aplicaciones en la biología celular y reacciones moleculares de autoensamblaje 7 – 12 que requiere de formación de imágenes con alta resolución temporal sobre muchos puntos de tiempo, estructurado microscopía de iluminación (SIM) puede ser muy adecuado, ya que no depende de las propiedades fotofísicas de un fluorescente particular, sonda. A pesar de esta ventaja inherente de SIM, hasta ahora su uso se ha limitado principalmente a las imágenes de células fijas o procesos de movimiento lento. Esto es debido a las limitaciones de los sistemas SIM disponibles en el mercado: la velocidad de cuadro de adquisición de estos instrumentos estaba limitada por la velocidad de rotación de las rejillas utilizadas para generar los patrones de iluminación sinusoidales requeridas, así como el mantenimiento de la polarización óptica. La nueva generación de SIM comercialinstrumentos son capaces de imágenes rápidas, pero su precio es prohibitivo para todos excepto para las instalaciones centrales de imagen.
Este protocolo presenta una guía para la construcción de un sistema flexible de SIM para obtener imágenes de procesos rápidos en muestras delgadas y cerca de la superficie basal de las células vivas. Se emplea fluorescencia de reflexión total interna (TIRF) para generar un patrón de iluminación que penetra más profundo que aproximadamente 150 nm en la muestra 13, que reduce enormemente la salida de la señal de fondo del foco. La idea de combinar SIM con TIRF es casi tan antigua como la propia SIM 14, pero no se realizó de forma experimental antes de 2006 15. La primera vez en vivo las imágenes obtenidas con TIRF-SIM se informó en 2009 16 han alcanzado velocidades de cuadro de 11 Hz para visualizar la tubulina y kinesin dinámica, y dos sistemas de TIRF-SIM de color se han presentado 17,18. Más recientemente, una guía para la construcción y el uso de un solo color de dos haces SIM sistema se presentó con el frame-rate de hasta 18 Hz 19,20.
La puesta a punto que aquí se presenta es capaz de SIM de super-resolución de imagen a 20 Hz en tres colores, dos de los cuales pueden ser operados en TIRF-SIM. Todo el sistema se construye alrededor de un marco microscopio invertido y utiliza una etapa de traducción xy motorizado con una etapa z piezo-accionada. Para generar los patrones de excitación sinusoidal necesarios para TIRF de SIM, el sistema presentado utiliza un modulador espacial de luz ferroeléctrico (SLM). rallado patrones binarios se muestran en el MST y los órdenes de difracción ± 1 resultantes se filtraron, se transmiten y se centró en el anillo TIR de la lente objetivo. Los desplazamientos y rotaciones de las rejillas de fase necesarias se aplican cambiando la imagen SLM mostrada. Este protocolo describe cómo construir y alinear una trayectoria tal excitación, detalles de la alineación de la trayectoria de emisión, y presenta muestras de prueba para asegurar una alineación óptima. También De escribas los problemas y retos particulares a alta velocidad TIRF-SIM en relación con el control de la polarización y la sincronización de los componentes.
Consideraciones de diseño y limitaciones
Antes de montar el sistema TIRF-SIM presentado en este protocolo, hay varias limitaciones de diseño a considerar que determinan la elección de los componentes ópticos. Todas las abreviaturas de los componentes ópticos se refieren a la Figura 1.
Espacial modulador de luz (SLM)
A ferroeléctrico SLM binario se utiliza en esta configuración, ya que es capaz de la conmutación de patrón de sub-milisegundo. MFEE nemáticos en escala de grises se pueden usar, pero estos ofrecen reducen en gran medida los tiempos de conexión. Cada dentro o fuera de píxel en una fase binaria SLM se impartir desplazamiento a la frente de onda plano incidente sea un π o 0 de fase, por lo tanto, si un patrón de red periódica se muestra en el SLM se operará como una difracción rejilla de fase.
ent "> reflexión interna total (TIR) Para lograr TIR y producir un campo evanescente, el ángulo de incidencia de los haces de excitación en la interfase vidrio-muestra debe ser mayor que el ángulo crítico . Esto establece el ángulo mínimo requerido incidente, y por lo tanto también la separación máxima, o periodo, del patrón de iluminación evanescente. El máximo ángulo incidente
(El ángulo de aceptación) está limitada por la apertura numérica (NA) de la lente objetivo que se puede calcular a partir de la definición
. Esto determina el patrón de espaciado mínimo alcanzable de acuerdo con la fórmula Abbe
que une NA y longitud de onda
a la separación mínima patrón <imgalt = "Ecuación" src = "/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg" />. En la práctica, un 1,49 NA de inmersión en aceite objetivo TIRF se obtiene un ángulo máximo de incidencia de alrededor de 79 ° y un período mínimo patrón en la muestra de 164 nm utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nm. Estos dos ángulos definen un anillo en la abertura posterior de la objetivo sobre el cual el instrumento logra TIR de iluminación (es decir. El anillo TIR) y en el que los focos dos de excitación debe colocarse con exactitud y precisión girar para generar cada patrón de iluminación.
Reconstrucción de imágenes TIRF-SIM requiere la adquisición de un mínimo de tres cambios de fase por la rotación del patrón, por lo tanto el período patrón SLM debe ser divisible por 3 (véase la figura 1). Por ejemplo, un período de 9 píxeles para la iluminación de 488 nm y 12 640 píxeles para la iluminación nm. Para una discusión completa de diseño del modelo del MST, incluyendo la optimización de sub-píxeles de patrón espaciado utilizando rejillas cizallados, Ver el trabajo previo de Kner et al. 16 y Lu-Walther et al. 20 La posición de los dos focos de excitación debe estar dentro de la anilla TIR para todas las longitudes de onda, sin embargo, el ángulo de difracción de los ± 1 órdenes del SLM es la longitud de onda dependiente. Para SIM estándar, imágenes multicolor se puede conseguir mediante la optimización del periodo de rejilla para la longitud de onda más larga, y tolerar una pérdida en el rendimiento de los canales más cortos. Para TIRF-SIM sin embargo, la optimización para una longitud de onda significa que la longitud de onda de otros focos ya no dentro del anillo TIR son. Por ejemplo, el uso de un periodo de red de 9 píxeles es suficiente para proporcionar TIRF de 488 nm, ya que los focos están en 95% del diámetro de la abertura hacia atrás y dentro del anillo de TIR, pero para 640 nm este período posicionaría los focos fuera la abertura. Por esta razón diferentes espaciamientos patrón de píxeles deben ser usados para cada longitud de onda de excitación.
La alineación de la trayectoria de excitación TIRF-SIMes extremadamente sensible a pequeños cambios en la posición del espejo dicroico (DM4 en la Figura 1) en el cuerpo del microscopio, mucho más que en el SIM convencional. No se recomienda el uso de una torreta giratoria filtro de cubo, en lugar utilizar una sola, espejo dicroico multi-banda, que se mantiene en una posición fija y diseñado específicamente para las longitudes de onda de excitación utilizadas. Es esencial que solamente se utilizan los más altos espejos dicroicos calidad. Estos requieren gruesas sustratos de al menos 3 mm, y se designan a menudo como "plano de formación de imágenes" por los fabricantes. Todos los otros sustratos conducen a la aberración intolerable y degradación de la imagen en TIRF-SIM.
control de la polarización
Para lograr TIRF-SIM es esencial para hacer girar el estado de polarización de la luz de excitación en sincronía con el patrón de iluminación de tal manera que permanece azimutal polarizada en el plano de la pupila objetivo con respecto al eje óptico (es decir,. s-polarizada). La alineación de la óptica de control de polarización dependerá del elemento óptico específico empleado, por ejemplo una célula Pockels 21, o una placa de media onda en una etapa de rotación motorizada 22. En este protocolo se utiliza un cristal líquido encargo retardador variable (LCVR), diseñado para proveer de onda completa (2π) retraso de todo el rango de longitud de onda de 488 a 640 nm, ya que permite la conmutación rápida (~ ms). Si se utiliza un retardador de cristal líquido, es esencial utilizar un componente de alta calidad: componentes estándar no son normalmente lo suficientemente estable como para dar un retardo de la constante en la duración del tiempo de exposición de la cámara que conduce a una borrosidad de la patrón de iluminación y bajo contraste de modulación . retardadores de cristal líquido también son fuertemente dependientes de la temperatura y requieren construidas en el control de la temperatura.
Sincronización
Los láseres se deben sincronizar con el MST. MFEE ferroeléctricos binarios están equilibrados internamente por sbrujas entre un estado encendido y apagado del estado. Los píxeles sólo actúan placas de onda como medio, ya sea en su estado activado o desactivado, pero no durante el tiempo de conmutación entre tramas. Por lo tanto, los láseres sólo deben estar encendidos durante los estados de encendido / apagado a través del LED de señal de habilitación del SLM para evitar la disminución del contraste patrón debido al estado intermedio de los píxeles. Un modulador acústico-óptico (AOM), alternativamente, podría ser utilizada como un obturador rápido si los láseres no pueden ser moduladas digitalmente.
Elección de las lentes
Sobre la base de estas limitaciones, el desmagnificación requerida del plano de SLM en el plano de muestra para producir los patrones de iluminación deseados se pueden determinar. Esto permite el cálculo de las distancias focales de las dos lentes L3 y L4 en el telescopio de retransmisión de la imagen y la lente condensadora de excitación L5. En este sistema a / de inmersión en aceite 1.49NA lente objetivo 100X se utiliza con 488 nm y 640 nm de excitación, por lo tanto, utiliza longitudes focales de 300 y 140 mmpara L4 y L3, y 300 mm para L5, dando un total de desmagnificación 357x, equivalente a un tamaño de píxel de SLM 38 nm en el plano de la muestra. El uso de esta combinación de lentes, SLM rejilla de períodos de 9 para 488 iluminación nm y 12 píxeles para 640 nm dan espaciamientos patrón de 172 y 229 nm en la muestra, que corresponde a ángulos de incidencia de 70 ° y 67 ° respectivamente. Para una interfaz vidrio-agua, el ángulo crítico es 61 °, y es independiente de la longitud de onda, por lo tanto estos dos espaciamientos patrón permiten excitación TIRF para ambas longitudes de onda. Una lente de objetivo equipado con un collar de corrección es útil para la corrección de aberraciones esféricas introducidas por variaciones en el espesor cubreobjetos, o si funciona a 37 ° C.
Reconstrucción de imagen
Una vez que los datos en bruto SIM ha sido adquirida es una cuestión de esfuerzo computacional para generar imágenes de super-resolverse en un proceso de dos pasos. En primer lugar, el patrón de iluminación tiene que ser determinada paracada imagen y en segundo lugar, los componentes del espectro de SIM se deben separar y recombinar apropiadamente como para duplicar el apoyo OTF efectiva (véase la Figura 6, inserciones).
El conocimiento preciso de los patrones de iluminación proyectado es de suma importancia, ya que los componentes de frecuencia de super-resuelto tienen que ser mezclado con la mayor precisión posible para evitar artefactos causados por las partes residuales de componentes superpuestos. Determinamos el patrón de iluminación parámetros a posteriori de los datos de imágenes en bruto siguiendo el procedimiento establecido por Gustafsson et al. 23 En resumen, un conjunto de parámetros de iluminación que describe una sinusoide de dos dimensiones normalizadas tiene que ser encontrado para cada una de las patrones de excitación
:
Por la presente y
describir el contraste franja y el patrón de la fase de arranque de cada imagen m individuo respectivamente. Los componentes del vector de onda,
y
, Sólo cambian con diferentes orientaciones
del patrón y lata supone que es de otro modo constante. Para determinar groseramente los componentes del vector de onda se realiza una correlación cruzada de los espectros de imágenes en bruto, que se refina mediante la aplicación de cambios de subpixel a una de las imágenes cruzada correlacionados como para optimizar la superposición. Esto se hace a través de la multiplicación de los gradientes de fase-espacio real
que inducen un cambio en los subpíxeles frecuencia-espacio. Observe que es útil tener una buena estimación de la onda-vectores antes de la estimación patrón real y esto se puede encontrar por la imagen de una capa de bolas fluorescentes.
A medida que el paso de fase entre los patrones desplazado es , Es decir.
, La separación de componentes de frecuencia puede ser realizada por una transformada de Fourier a lo largo de los "eje de fase". La fase mundial
y el contraste de la franja
a continuación, se puede determinar usando regresión lineal compleja de diferentes componentes. Los componentes individuales separados se combinan a continuación, utilizando un filtro de Wiener generalizada. Para una descripción detallada tanto de extracción de parámetros y la aplicación del filtro de Wiener generalizado remitimos al lector a Gustafssonet al. 23, donde se utiliza el mismo algoritmo.
Hechas a medida sistemas TIRF-SIM como la configuración se detalla en este protocolo son capaces de imágenes multicolores de super-resolución a alta velocidad en comparación con los microscopios disponibles en el mercado. La ventaja inherente de SIM como una técnica de super-resolución es que la resolución temporal no está limitado por los fotofísica del fluoróforo, en comparación con otros métodos, como única molécula de microscopía de localización (SMLM) o métodos de exploración de punto tales como la microscopía de agotamiento de la emisión estimulada ( STED). A diferencia de estas otras técnicas, SIM no requiere fluoróforos photoswitchable o no renovables de modo de imagen multicolor es sencillo. sistemas TIRF-SIM no, como óptica de seccionamiento SIM y multifocal SIM generalmente pueden lograr mejoras en la resolución de 1,7 veces o menos en la práctica en comparación con el factor de 2 mejora informado aquí, y sistemas comerciales también son a menudo más lento y menos flexible que el sistema de presentado en este protocolo.
"> Las dos dificultades principales en la aplicación de esta técnica son en primer lugar la necesidad de un posicionamiento preciso de las seis vigas SIM dentro de la zona TIR de la abertura posterior del objetivo, que requiere un tiempo de laborioso y consume procedimiento de alineación óptica. En segundo lugar, para producir alto contraste patrón en la muestra, la rotación de la polarización es esencial. para los sistemas de NA 2D-SIM bajos, la rotación de la polarización se puede evitar mediante una cuidadosa elección de la orientación de la polarización lineal, pero esto se hace imposible para TIRF-SIM 25. para imágenes multicolor de alta velocidad, electro- control de la polarización óptica es necesaria y esto aumenta la complejidad y el costo del sistema.Las limitaciones de la técnica
TIRF-SIM, como TIRF convencional, es, naturalmente, limitada a la observación de las estructuras y procesos localizados en la membrana celular basal que puede ser iluminado por la profundidad de penetración 150 a 200 nm del campo evanescente biológicos. MientrasSIM es a menudo citado como menos photodamaging a las células que cualquiera STED o SMLM, resolución duplicación lateral tiene todavía aumentar el número requerido de fotones por al menos 4 veces 5 en comparación con la microscopía TIRF convencional. Para imágenes en alta velocidad de cuadros con exposiciones breves momentos, este aumento de fotones hace necesario el uso de mayores intensidades de iluminación. Mientras que cualquier fluoróforo se puede utilizar para obtener imágenes de muestras SIM móviles fijos o lentos, proteínas fluorescentes de alta luminosidad o tintes sintéticos de nueva generación con fotoestabilidad mejorada se recomiendan para imágenes de células vivas.
Aunque esta aplicación es capaz de formar imágenes de un solo color a velocidades de cuadro SIM en exceso de 20 Hz, de formación de imágenes multicolor en el sistema presentado está limitado por el tiempo de conmutación de la rueda de filtro de emisión motorizado. Debido al gran tamaño del chip de la cámara sCMOS, el uso de un filtro de emisión de multibanda y de imagen óptica de división sería posible y permitir i simultáneaMaging con múltiples longitudes de onda a ninguna pérdida de velocidad. Otra posibilidad sería la de alternar los diferentes láseres de excitación y utilizar un filtro de muesca multibanda para rechazar la luz de excitación. El uso de un SLM ferroeléctrico binario en esta implementación también no es óptima. La eficiencia de difracción de un SLM de este tipo es muy baja, por lo que la mayor parte de la luz incidente es en la reflexión de orden cero, que se filtra por la máscara espacial. Para aplicaciones que requieren velocidades de fotogramas muy altas, la velocidad de formación de imágenes está por lo tanto limitada por la potencia de salida de los diodos láser. El MST también introduce algunas elipticidad en la polarización para longitudes de onda de distancia de la longitud de onda de diseño de 550 nm, donde los píxeles no funcionan placas de media onda como ideales. Aunque esto podría compensarse mediante el uso de una LCVR adicional, la solución ideal puede ser el uso de un dispositivo de micro-espejo digital (DMD) como un generador de patrones.
Las posibles modificaciones
La configuración presented aquí es flexible y más fácil de modificar que los instrumentos comerciales para que otras modalidades de imágenes tales como 3D-SIM, rápido 2D-SIM, SIM multifocal (MSIM) y SIM no lineal (NL-SIM) se pueden implementar 21,34,35.
2D-SIM puede ser muy adecuado para la formación de imágenes relativamente plana, de movimiento rápido estructuras tales como el retículo endoplasmático periférica. El ER periférica es más profundo dentro de la célula que puede ser iluminado mediante un campo evanescente TIRF pero debido a su estructura plana se pueden obtener imágenes utilizando el estándar 2D-SIM con insignificante fondo fuera de foco. Además, el uso de mejores algoritmos de reconstrucción de seccionamiento óptico para suprimir fuera de foco de luz se extiende el uso de 2D-SIM para muestras ópticamente gruesas, aunque donde no se requiere una resolución axial de 21 duplicación.
En MSIM, la muestra es iluminada por una celosía escasa de focos de excitación 36. Esta modalidad puede ser implementado por la simple eliminación de la máscara espacial (SM) Y su sustitución por un polarizador. El SLM ahora funciona como un modulador de amplitud. Las rejillas SIM binarias que aparecen en el SLM pueden ser reemplazados por una celosía 2D de manchas, con el tamaño de los lugares elegidos para ser igual al tamaño de un enfoque limitado de difracción en el plano de la imagen. En la Figura 7A, un enrejado de 4 x 4 píxeles cuadrados se muestra en el SLM (recuadro) que cuando demagnified sobre la muestra genera difracción focos limitados de 150 x 150 nm, dado el tamaño SLM pixel física de 13,62 m. Los focos de excitación se puede traducir al cambiar el patrón reticular en el MST y esto se repite varias veces con el fin de iluminar todo el campo de visión. Las imágenes se adquieren para cada posición del patrón traducida y la pila es post-procesados para producir una imagen reconstruida con una mejor resolución de hasta un factor de y la reducción de fuera de foco de luz en comparación con la imagen de campo amplio equivalente30. Esta modalidad puede ser útil para la formación de imágenes gruesas muestras y densos para los que SIM estándar no es adecuado, por ejemplo, las estructuras de bajo contraste, tales como células rojas de la sangre teñidas (Figura 7C), aunque el tiempo de adquisición se incrementa debido a la gran cantidad de marcos primas requerido por campo de visión (en este caso N = 168).
Por último, la configuración puede ser modificado para permitir que sea de alta NA lineal TIRF-SIM o activación modelado no lineal SIM (PA NL-SIM), tal como se presenta recientemente por Li et al., Mediante el uso de un 1,7 objetivo o adición ultra alta NA de un láser de fotoactivación 405 nm y optimización cuidadosa de los patrones de rejilla SLM 35.
Las aplicaciones futuras
SIM es todavía una técnica rápida evolución y muchas aplicaciones en las ciencias de la vida se habilitará en el futuro. La velocidad, la resolución y mejoras de contraste de la técnica y la capacidad de utilizar fluoróforos estándar mean que para bioimagen, SIM está configurado para reemplazar muchos sistemas de microscopio convencionales, tales como plataformas de campo confocal y de ancho. Los sistemas SIM comerciales ya están disponibles hoy en día con las especificaciones técnicas pendientes, sin embargo, están fuera del alcance económico de muchos laboratorios de investigación, y, sobre todo, son inflexibles para ser modificado y desarrollado para implementar las investigaciones más recientes en el campo. También carecen de la capacidad esencial para 'ser adaptado para el experimento a la mano ", a menudo un cuello de botella crítico en la reducción de la investigación biológica borde. El sistema descrito aquí será especialmente adecuado para estudiar los procesos dinámicos cerca de la superficie de la célula, para estudios in vitro de los sistemas bicapa reconstituidas, para estudiar la química de superficie en los materiales y las ciencias físicas, por ejemplo. de materiales 2D, y muchas otras aplicaciones.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Leverhulme, la Ingeniería y Ciencias Físicas de Investigación [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [Aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] y Consejo de Investigación Médica [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Agradecemos a E. Avezov y M. Lu para la transfección de la LifeAct-GFP y células citosólica-GFP, respectivamente, y W. Chen para la preparación de la cultura HEK293. Agradecemos también a K. O'Holleran para obtener ayuda con el diseño del microscopio, y L. Shao y R. Heintzmann para las discusiones y sugerencias útiles.
488 nm laser | Toptica | iBeam SMART | with digital modulation |
561 nm laser | Coherent | OBIS LS | with digital modulation |
640 nm laser | Cobolt | MLD | with digital modulation |
Long-pass dichroic mirrors | Thorlabs | for combining excitation beams | |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | From same batch as above, 25 x 25 mm |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-860 | |
Glan-Taylor calcite polarizers | Thorlabs | GT5-A | For alignment of LCVR |
Glan-Taylor mount | Thorlabs | SM05PM5 | |
Achromatic half wave plate | Thorlabs | AHWP05M-600 | 400 – 800 nm |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | For HWP |
Liquid Crystal Variable Retarder | Meadowlark Optics | SWIFT | Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm. |
LCVR controller | Meadowlark Optics | D3060HV | Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders |
Achromatic quarter wave plate | Meadowlark Optics | AQM-100-0545 | |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1P/M | For QWP |
10 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC080-010-A-ML | For beam expander |
200 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC254-200-A-ML | For beam expander |
Cage XY Translators | Thorlabs | CXY1 | |
Ferroelectric spatial light modulator | Forth Dimension Displays | M0787-00249 | SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board |
SLM mounting frame | Forth Dimension Displays | M0787-10014 | Fixed to custom built aluminium mount |
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount | Thorlabs | GM200/M | For SLM mounting |
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform | Thorlabs | XYR1/M | For SLM mounting |
Rail carrier | Newport | M-PRC-3 | For SLM mounting |
Precision Optical Rail | Newport | PRL-6 | For SLM mounting |
300 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 273 322 | f = 300 mm, 31.5 mm diameter |
140 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 239 322 | f = 140 mm, 31.5 mm diameter |
Precision XY Translation Mounts | Thorlabs | LM2XY | |
Lens Mounting Adapters | Thorlabs | SM2AD32 | For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts |
Translation stages | Comar | 12XT65 | Dovetail, side drive |
XY Translator with Differential Drives | Thorlabs | ST1XY-D/M | for spatial filter |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | for spatial filter |
300 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC508-300-A-ML | Excitation tube lens |
Automated XY stage with Z-piezo top plate | ASI | PZ-2150-XYFT-PZ-IX71 | with MS-2000 controller |
Inverted microscope frame | Olympus | IX-71 | |
Objective lens | Olympus | UAPON100XOTIRF | 100X/1.49NA |
High speed filter wheel | Prior Scientific | HF110A | with Prior ProScan III controller |
Bandpass emission filters | Semrock | FF01-525/30, FF01-676/29 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | |
Stage top incubator | OKO Lab | H301-K-FRAME | For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers |
Stainless steel optical posts | Thorlabs | TR series | for mounting optical components |
Post holders | Thorlabs | PH series | for mounting optical components |
Kinematic mirror mounts | Thorlabs | KM100 | for mounting 1" mirrors |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
100 nm fluorescent microspheres | Life Technologies | T-7279 | Tetraspeck |
Rhodamine 6G | Sigma Aldrich | 83697-250MG | |
8 well glass bottom dishes | ibidi | 80827 | with #1.5 coverglass |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | with #1.5 coverglass |
0.01mm microscope reticle slide | EMS | 68039-22 | |
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific | C10613 |