Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Hepatocytes 1, जो जिगर के प्रमुख parenchymal सेल प्रकार हैं की उल्लेखनीय उत्थान क्षमता के बावजूद, जीर्ण जिगर की विफलता इस क्षमता को बाधित, यकृत पूर्वज सेल (एचपीसी) निर्भर उत्थान 2 के लिए अग्रणी।
जीर्ण जिगर की क्षति मुख्य रूप से शराब के सेवन, क्रोनिक हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) के संक्रमण 3 और गैर शराबी फैटी लीवर रोग (NAFLD) 4 से ली गई है। यह निरंतर जिगर फाइब्रोसिस, जो बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन का संचय के साथ जुड़ा हुआ है की ओर जाता है। बने ईसीएम संचय एक रेशेदार निशान ऊतक के गठन 5, बाद में उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के साथ सिरोसिस में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा बरकरार यकृत वास्तुकला विकृत। कई प्रयासों के profibrogenic साइटोकिन्स और सक्रिय myofibroblasts 6 बाधा पर ध्यान केंद्रित करके मुख्य रूप से fibrotic प्रतिक्रिया को कम करने के लिए बनाया गया है। मुख्य रूप से उत्तरार्द्ध एच यकृत तारामय कोशिकाओं से प्राप्त होता है (एससी), सिद्धांत यकृत गैर parenchymal जिगर निशान गठन 4 के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं। फिर भी, पुनर्योजी चिकित्सा कि निरंतर fibrogenic अपमान की उपस्थिति में hepatocytes पुनर्जीवित करने HPCs सहित अंतर्जात सेलुलर स्रोतों को प्रोत्साहित आगे की जांच का इंतजार है।
यकृत फाइब्रोसिस से कई प्रयोगात्मक मॉडल स्तनधारियों में वर्णित किया गया है। कार्बन टेट्राक्लोराइड (सीसीएल 4) के दोहराव इंजेक्शन व्यापक रूप से murine और चूहे मॉडल 7 में जिगर फाइब्रोसिस प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। जब एक उच्च वसा (एचएफ) आहार के साथ संयुक्त, शराब profibrogenic जीन अभिव्यक्ति और यकृत फाइब्रोसिस 8 का एक बड़ा अपरेगुलेशन का नेतृत्व किया। स्टीटोसिस (लिपिड संचय) तीव्र शराब जोखिम का परिणाम है, यह जिगर और अधिक गंभीर यकृत की चोट से 9 अतिसंवेदनशील बनाता है।
Zebrafish, Danio rerio, उत्थान के अध्ययन के लिए एक अमूल्य हड्डीवाला मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। हालांकिऐसे newts और axolotls के रूप में अन्य निचले रीढ़ zebrafish संभावित पुनर्योजी में हेरफेर करने के लिए जरूरी जीन में गड़बड़ी और दृश्य रणनीतियों के संबंध में अन्य मॉडल प्रणाली से अधिक लाभ है 10 कारकों, उत्थान के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता है। zebrafish भी बस अपने पानी के लिए इथेनॉल (EtOH) जोड़कर शराबी जिगर की बीमारी (ALD) के अध्ययन के लिए एक आकर्षक कशेरुकी मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। लार्वा और वयस्क zebrafish को एक्यूट EtOH जोखिम यकृत स्टीटोसिस 11-13 का कारण बना। वयस्क zebrafish बढ़ाया EtOH जोखिम प्राप्त है, कोलेजन बयान फाइब्रोसिस से संबंधित जीन 14 की upregulation के साथ मनाया गया। हालांकि, एक की जरूरत मॉडल के विकास के लिए एक प्रोत्साहन के रूप में fibrogenic EtOH के जवाब में जिगर उत्थान का अध्ययन करने के लिए मौजूद है।
हाल ही में, हम zebrafish 15 में एक EtOH प्रेरित fibrotic जिगर मॉडल विकसित किया है। हम लार्वा और adul में EtOH उपचार के साथ एक hepatocyte विशेष आनुवंशिक पृथक प्रणाली संयुक्तटी zebrafish। हम दो ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न, टीजी (fabp10a: CFP-एनटीआर) GT1 और टीजी (fabp10a: mCherry-एनटीआर) GT2, जिसमें कोलाई nitroreductase (एनटीआर) क्रमश: सियान और mCherry फ्लोरोसेंट प्रोटीन, करने के लिए जुड़े हुए हैं नियंत्रण के तहत, hepatocyte विशेष फैटी एसिड प्रोटीन 10A, जिगर बुनियादी (fabp10a) प्रमोटर बंधन की। इस प्रणाली में, एनटीआर एक nontoxic प्रोड्रग metronidazole (MTZ) एक डीएनए अंतर-कतरा पार से जोड़ने एजेंट 16 में धर्मान्तरित, hepatocytes की स्पष्ट मौत उत्प्रेरण। इस मॉडल का उपयोग करना, हम दिखा दिया है कि यकृत कोशिकाओं है, जो पायदान संकेतन के लिए उत्तरदायी हैं की आबादी, hepatocytes के पास अभाव में और ईसीएम से अधिक hepatocytes में बदल दिया। हम HPCs के रूप में इन कोशिकाओं को नामित किया गया। इसके अलावा, रासायनिक स्क्रीन के माध्यम से, हम WNT सिगनल के छोटे अणु उत्प्रेरक और पायदान संकेतन के अवरोधकों कि fibrotic जिगर में hepatocyte उत्थान बढ़ाने की पहचान की। therefoफिर से, zebrafish में हमारे fibrotic जिगर मॉडल सेल संस्कृति या स्तनधारी आधारित स्क्रीनिंग प्रणाली की तुलना में एक शानदार रासायनिक स्क्रीनिंग प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है। यह महत्वपूर्ण लागत और समय की बचत लाभ के साथ एक में विवो प्रणाली है। यहाँ हम एक EtOH प्रेरित fibrotic जिगर मॉडल की स्थापना के लिए और zebrafish में इस मॉडल का उपयोग रासायनिक स्क्रीन प्रदर्शन के लिए विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन है। इसके अलावा, समय पाठ्यक्रम का विश्लेषण कैसे hepatocyte उत्थान fibrotic जिगर में होता जांच करने के लिए प्रदर्शन किया गया। इस प्रोटोकॉल तंत्र और fibrotic जिगर में hepatocyte उत्थान को बढ़ाने की रणनीति का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करेगा।
हम EtOH / MTZ इलाज उबरने के यकृत में एचपीसी की मध्यस्थता hepatocyte उत्थान मनाया, सुझाव है कि यहां तक कि fibrillar प्रकार मैं कोलेजन सहित ईसीएम प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा की उपस्थिति में, HPCs hepatocytes के रूप में पुनर्जीवित कर…
The authors have nothing to disclose.
इस काम GTEC (2731336 और 1411318), एनआईएच (K01DK081351), और NSF (1354837) सीएचएस करने से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Alem Giorgis धन्यवाद।
Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
24-well plate | VWR | 10062-896 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
Stereo microscope | Leica | M80 | |
Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |