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Medicine

संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और महाधमनी कड़ा हो जाना और सूजन की इमेजिंग की हड्डी बन जाना

Published: May 31, 2016
doi:
10.3791/54017
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1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine,Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine,Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division,Brigham and Women’s Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology,Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine,Massachusetts General Hospital

Summary

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Abstract

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Introduction

जहां यह सालाना 780,000 से अधिक लोगों की मृत्यु के लिए खातों हृदय रोग दुनिया में रुग्णता और मृत्यु दर का प्रमुख कारण, संयुक्त राज्य अमेरिका सहित है। 1 कोरोनरी धमनी कड़ा हो जाना और महाधमनी कड़ा हो जाना atherosclerotic रोग की पहचान कर रहे हैं और हृदय की घटनाओं के रूप में मजबूत भविष्यवक्ताओं सेवा करते हैं। 2- , intimal कड़ा हो जाना atherosclerosis के साथ जुड़े हैं, और औसत दर्जे का कड़ा हो जाना, क्रोनिक किडनी रोग और मधुमेह के साथ जुड़े (के रूप में भी जाना जाता है Mönckeberg) 5 अंत: कड़ा हो जाना लिपिड संचय और मैक्रोफेज की सेटिंग में होता है: 4 दो संवहनी कड़ा हो जाना के मुख्य प्रकार वयस्कों की रिपोर्ट में किया गया है। पोत दीवार में घुसपैठ। 5,6 औसत दर्जे का दीवार कड़ा हो जाना के आणविक तंत्र पर intimal कड़ा हो जाना की स्वतंत्र रूप से होता है, इलास्टिन फाइबर या चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के लिए localizes, और लिपिड बयान या बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ के साथ संबद्ध नहीं है। 5,7,8 अध्ययनसंवहनी कड़ा हो जाना सेल आधारित और पशु मॉडल प्रणाली पर भरोसा किया है। Atherocalcific रोग के लिए कृंतक मॉडल, या तो apolipoprotein ई (ApoE) 9,10 या कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (LDLR) 11 एक उच्च वसा वाले आहार खिलाया में चूहों की कमी शामिल है, जबकि औसत दर्जे का कड़ा हो जाना के लिए मॉडल मैट्रिक्स Gla प्रोटीन के साथ चूहों में शामिल हैं (एमजीपी) की कमी 12 या चूहों कि या तो पास कुल nephrectomy (5/6 nephrectomy मॉडल) द्वारा या एक उच्च adenine आहार के लिए जोखिम के यूरीमिया विकसित करना। 13

इधर, औसत दर्जे का संवहनी एमजीपी की कमी के साथ जुड़े कड़ा हो जाना के मॉडल पर ध्यान केंद्रित किया है। एमजीपी एक बाह्य प्रोटीन है कि धमनी कड़ा हो जाना रोकता है। एमजीपी जीन में म्यूटेशन 12 Keutel सिंड्रोम, एक दुर्लभ मानव रोग brachytelephalangy के अलावा फैलाना उपास्थि कड़ा हो जाना द्वारा विशेषता, सुनवाई हानि, और परिधीय फेफड़े के एक प्रकार का रोग में पहचान की गई है। 14-18 हालांकि नहीं अक्सर मनाया, 19कई धमनियों का कड़ा हो जाना गाढ़ा Keutel सिंड्रोम में वर्णित किया गया है। मानव एमजीपी जीन में 20 आम बहुरूपताओं कोरोनरी धमनी कड़ा हो जाना के लिए बढ़ा खतरा, 21-23 के साथ जुड़े रहे uncarboxylated, जैविक रूप से निष्क्रिय एमजीपी के उच्च स्तरों घूम हृदय मृत्यु दर की भविष्यवाणी करते हुए। 24 मनुष्य के विपरीत Keutel सिंड्रोम के साथ, एमजीपी की कमी चूहों की उम्र के दो सप्ताह में शुरू करने और जन्म के बाद 6-8 सप्ताह मर महाधमनी फटने के कारण सहज व्यापक धमनी कड़ा हो जाना से मिलकर एक गंभीर संवहनी phenotype का विकास। 12

ApoE के विपरीत – / – और LDLR – / – चूहों एक उच्च वसा वाले आहार खिलाया, जो जुड़े मैक्रोफेज प्रेरित सूजन के साथ intimal संवहनी कड़ा हो जाना विकसित करने, एमजीपी – / -। चूहों बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ के अभाव में औसत दर्जे का संवहनी कड़ा हो जाना विकसित 11,25 यद्यपि इन निष्कर्षों Intim के लिए अलग अंतर्निहित उत्तेजनाओं का सुझावअल और औसत दर्जे का कड़ा हो जाना, वहाँ संकेतन तंत्र है कि कड़ा हो जाना। 26 एकाधिक संकेत दे रास्ते पहचान की गई है के दोनों रूपों है कि इस तरह के ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α और आईएल -1 और समर्थक osteogenic कारकों के रूप में सूजन मध्यस्थों सहित संवहनी कड़ा हो जाना करने के लिए योगदान मध्यस्थता में ओवरलैप है इस तरह के पायदान, wnt, और हड्डी morphogenetic प्रोटीन (बीएमपी) संकेत है। 27,28 के रूप में ये संकेत दे रास्ते प्रतिलेखन कारक छोटा सा व्यक्ति से संबंधित प्रतिलेखन कारक 2 (Runx2) और osterix, जो बारी में हड्डी से संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने की अभिव्यक्ति (वृद्धि । जैसे, osteocalcin, sclerostin, और क्षारीय फॉस्फेट) वाहिका कि कड़ा हो जाना मध्यस्थता में 28-30 हम और दूसरों को दिखा दिया है कि संवहनी कड़ा हो जाना ApoE में मनाया – / – और LDLR – / – चूहों एक उच्च वसा वाले आहार और सहज तंग आ गया संवहनी कड़ा हो जाना में एमजीपी मनाया – / – चूहों सब हड्डी morphogenetic प्रोटीन पर निर्भर (बीएमपी) signaling, और यह इस मार्ग है कि यहाँ पर ध्यान केंद्रित कर रहा है। 11,25,31 BMPs शक्तिशाली osteogenic हड्डी गठन के लिए आवश्यक कारक हैं और मानव atherosclerosis में वृद्धि की अभिव्यक्ति प्रदर्शन करने के लिए जाना जाता है। 32-34 में इन विट्रो अध्ययन के विनियमन में बीएमपी सिगनल फंसा है ऐसे Runx2 के रूप में osteogenic कारकों की अभिव्यक्ति। बीएमपी ligand के 35-37 overexpression, बीएमपी -2, एक उच्च वसा वाले आहार खिलाया ApoE की कमी चूहों में संवहनी कड़ा हो जाना का विकास इसके अलावा इस तरह के संकेत अवरोधकों विशिष्ट बीएमपी के उपयोग accelerates। 38, LDN-193189 (LDN) के रूप में 39,40 और / या ALK3-एफसी दोनों LDLR में संवहनी कड़ा हो जाना के विकास को रोकता – / – चूहों एक उच्च वसा वाले आहार और एमजीपी की कमी चूहों तंग आ 11,25।

संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) संवहनी कड़ा हो जाना के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका औसत दर्जे का संवहनी कड़ा हो जाना कि में विकसित करता है। 30,41,42 एमजीपी की कमी चूहों चरित्र हैएक osteogenic phenotype के लिए VSMCs की एक transdifferentiation द्वारा terized। myocardin और अल्फा चिकनी पेशी actin सहित VSMC मार्कर की कमी आई है अभिव्यक्ति में एमजीपी परिणामों की हानि, ऐसे Runx2 और osteopontin के रूप में osteogenic मार्कर में एक सहवर्ती वृद्धि के साथ। इन परिवर्तनों संवहनी कड़ा हो जाना के विकास के साथ मेल खाना। 25,43,44

महाधमनी कड़ा हो जाना और चूहों में सूजन आम तौर पर इस तरह के जल्दी कड़ा हो जाना और osteogenic गतिविधि, देर से कड़ा हो जाना के लिए वॉन Kossa और Alizarin लाल धुंधला के लिए alkaline फॉस्फेट गतिविधि और immunohistochemical प्रोटोकॉल है कि बृहतभक्षककोशिका प्रोटीन मार्कर (जैसे। लक्ष्य के रूप में histochemical तकनीक का उपयोग मूल्यांकन कर रहे हैं, CD68, F4 / 80, मैक-1, मैक-2, मैक-3)। 9,45 हालांकि, इन मानक इमेजिंग तकनीक के पार वर्गों में महाधमनी के ऊतकों के प्रसंस्करण, जो नमूना पूर्वाग्रह की वजह से समय लगता है और अपूर्ण है की आवश्यकता होती है, और में सीमित कर रहे हैं उनके सूजन और calcificat यों की क्षमतापूरे महाधमनी में आयन। इस प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन कल्पना और पूरे महाधमनी और मध्यम आकार के धमनी कड़ा हो जाना और मैक्रोफेज संचय लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट (NIR) आणविक इमेजिंग पूर्व vivo उपयोग यों की। इसके अलावा प्रदान की कटाई और चूहों से प्राथमिक महाधमनी VSMCs संवर्धन और उत्प्रेरण के लिए एक विधि है आदेश में murine और इन विट्रो में मानव VSMCs का कड़ा हो जाना संवहनी कड़ा हो जाना अंतर्निहित आणविक तंत्र निर्धारित करने के लिए। इन तकनीकों में विवो में और atherocalcific रोग के अध्ययन के लिए इन विट्रो तरीकों में दोनों के साथ अन्वेषक प्रदान करते हैं।

Protocol

चूहों के साथ सभी अध्ययनों की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों की प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार प्रदर्शन किया गया। हाउसिंग और इस अध्ययन में वर्णित चूह?…

Representative Results

/ – – एमजीपी में महाधमनी कड़ा हो जाना और जंगली प्रकार चूहों कैल्शियम NIR प्रतिदीप्ति की इमेजिंग का उपयोग मापा गया था। कोई कैल्शियम NIR संकेत प्रकार के जंगली चूहों से aortas में पता चला था, कड़ा हो …

Discussion

धमनी कड़ा हो जाना मनुष्यों में हृदय रोग के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है और हृदय की घटनाओं के रोगजनन के लिए सीधे योगदान कर सकते हैं। Atherosclerotic रोग की पतली रेशेदार टोपी में 1,5,52 अंत: कैल्शियम बयान स्थानी…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB and TET), the Howard Hughes Medical Institute (TM), the Ladue Memorial Fellowship Award from Harvard Medical School (DKR), the START-Program of the Faculty of Medicine at RWTH Aachen (MD), the German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), the National Eye Institute (R01EY022746, ESB), the Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signaling in the Pathogenesis of Pulmonary and Systemic Vascular Diseases, PBY, KDB, and DBB), the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01AR057374, PBY), the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK082971, KDB and DBB), the American Heart Association Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM), and the National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL114805 and R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).

Materials

15 ml conical tube Falcon 352096
30 G needle BD 305106
Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
Dexamethasone Sigma D4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
Elastase Sigma E1250
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
Forceps, fine point Roboz RS-4972
Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
L-ascorbic acid Sigma A-7506
Micro-dissecting spring scissors (13mm) Roboz RS-5676
Micro-dissecting spring scissors (3mm) Roboz RS-5610
NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
Normal Saline Hospira 0409-4888-10
Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
Sodium thiosulfate Sigma S-1648
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
Tissue culture plate (35mm x 10mm) Falcon 353001
Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
Trypsin Corning 25-053-CI
Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525
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O’Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).
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