Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.
Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.
Hjerte- og karsykdommer er den ledende årsak til sykelighet og dødelighet i verden, inkludert USA, hvor det står for mer enn 780 000 dødsfall årlig. 1 Koronar forkalkning og aortic forkalkning er kjennetegnene ved aterosklerotisk sykdom og tjene som sterke prediktorer for kardiovaskulære hendelser. 2- 4 To hovedtyper av vaskulære forkalkning er rapportert hos voksne: intima forkalkning, assosiert med aterosklerose, og medial (også kjent som Monckeberg) forkalkning, assosiert med kronisk nyresykdom og diabetes 5 intimaoverflaten forkalkning oppstår i innstillingen av lipid akkumulering og makrofag. infiltrasjon i åreveggen. 5,6 Medial vegg forkalkning oppstår uavhengig av intima forkalkning, lokaliserer til elastin fiber eller glatte muskelceller, og er ikke forbundet med lipid deponering eller makrofag infiltrasjon. 5,7,8 studier på de molekylære mekanismervaskulær forkalkninger har stolt på cellebasert og dyremodellsystemer. Gnagermodeller for atherocalcific sykdom inkluderer mus som mangler enten apolipoprotein E (ApoE) 9,10 eller low-density lipoprotein reseptor (LDLR) 11 matet en fettrik diett, mens modeller for medial forkalkning inkluderer mus med matrix Gla protein (MGP) mangel 12 eller rotter som utvikler uremia enten ved nær total nefrektomi (5 / sjette nefrektomi modell), eller ved eksponering for en høy-adenin diett. 13
Her er modellen av mediale vaskulær forkalkning i forbindelse med MGP mangel fokusert på. MGP er et ekstracellulært protein som inhiberer arteriell forkalkninger. 12 Mutasjoner i MGP-genet er blitt identifisert i Keutel syndrom, en sjelden human sykdom karakterisert ved diffus brusk forkalkning i tillegg til brachytelephalangy, hørselstap, og perifere pulmonalstenose. 14-18 Selv om det ikke er ofte observert, 19konsentriske forkalkning av flere arterier har blitt beskrevet i Keutel syndrom. 20 Felles polymorfismer i menneske MGP-genet er assosiert med økt risiko for koronar forkalkning, 21-23 mens høyere sirkulerende nivåer av uncarboxylated, biologisk inaktivt MGP forutsi kardiovaskulær dødelighet. 24 I motsetning til mennesker med Keutel syndrom, MGP-mangelfull mus utvikler en alvorlig vaskulær fenotype som består av spontan utbredt arteriell forkalkning starter på to uker gamle og dør 6-8 uker etter fødselen på grunn av aorta ruptur. 12
I motsetning til ApoE – / – og LDLR – / – mus foret med en fettrik diett, som utvikles intimal vaskulær forkalkning med tilhørende makrofag-indusert inflammasjon, MGP – / -. Mus utvikler medial vaskulær forkalkning i fravær av makrofagin 11,25 Selv disse funnene tyder ulike underliggende stimuli for intimal og medial forkalkning, det er overlapping i signalmekanismer som formidler begge former for forkalkninger. 26 flere signalveier har blitt identifisert som bidrar til vaskulær forkalkninger inkludert inflammatoriske mediatorer som tumornekrosefaktor-α og IL-1 og pro-osteogene faktorer såsom hakk, Wnt, og benmorfogenetisk protein (BMP) signalering. 27,28 Disse signalveier øke ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer runt relaterte transkripsjonsfaktor 2 (Runx2) og osterix, som i sin tur øker ekspresjon av ben-relaterte proteiner ( . f.eks osteocalcin, sclerostin, og alkalisk fosfatase) i blodkar som megle forkalkning 28-30 Vi og andre har vist at den vaskulære forkalkning observert i ApoE – / – og LDLR – / – mus matet en fettrik diett og spontan vaskulære forkalkning observert i MGP – / – mus alt avhenge benmorfogenetisk protein (BMP) signaling, og det er denne reaksjonsvei som er fokusert på her. 11,25,31 BMP er potente osteogene faktorer som kreves for bendannelse og er kjent for å utvise økt ekspresjon i humane aterosklerose. 32-34 In vitro-studier har innblandet BMP signalering i regulering ekspresjon av osteogene faktorer som Runx2. 35-37 Overekspresjon av BMP-ligand, BMP-2, akselererer utviklingen av vaskulær forkalkning i ApoE-mangelfulle mus foret med en diett med høyt fettinnhold. 38 Videre, ved bruk av spesifikke BMP signale inhibitorer slike som LDN-193189 (LDN) 39,40 og / eller ALK3-Fc hindrer utvikling av vaskulære forkalkning i begge LDLR – / – mus matet en fettrik diett og MGP-mangelfull mus 11,25.
Vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) har en avgjørende rolle i utviklingen av vaskulær forkalkninger. 30,41,42 Den mediale vaskulære forkalkning som utvikler seg i MGP-mangelfull mus er karakterisertsert av en transdifferensiering av VSMCs til en osteogene fenotype. Tap av MGP resulterer i redusert uttrykk for VSMC markører inkludert myocardin og alfa glatt muskulatur aktin, med en samtidig økning i osteogene markører som Runx2 og osteopontin. Disse endringene faller sammen med utviklingen av vaskulær forkalkning. 25,43,44
Aorta forkalkninger og betennelser i mus er vanligvis vurderes å benytte histochemical teknikker som alkalisk fosfatase aktivitet for tidlig forkalkning og osteogene aktivitet, von Kossa og Alizarin rød farging for sent forkalkning, og immunhistokjemiske protokoller som er rettet mot makroproteinmarkører (f.eks., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 imidlertid har disse vanlige avbildningsteknikker krever behandling av aortisk vev i tverrsnitt, noe som er tidkrevende og ufullkommen på grunn av skjevhet prøvetaking, og er begrenset i sin evne til å kvantifisere betennelse og calcification i hele aorta. Denne protokollen beskriver en metode for å visualisere og kvantifisere hele aorta og mellomstore arteriell kalsifisering og makrofag-akkumuler anvendelse av nær-infrarødt, fluorescent (NIR) molekylær avbildning ex vivo. Også tilveiebrakt er en fremgangsmåte for høsting og dyrking av primære aorta VSMCs fra mus og indusere forkalkning av murine og humane VSMCs in vitro for å bestemme de molekylære mekanismer som ligger til grunn for vaskulær forkalkning. Disse teknikker gir undersøkeren med både in vivo og in vitro metoder for å studere atherocalcific sykdom.
Arteriell forkalkning er en viktig risikofaktor for kardiovaskulær sykdom hos mennesker og kan bidra direkte til patogenesen av kardiovaskulære hendelser. 1,5,52 intima kalsium deponering i tynne fiber caps av aterosklerotisk sykdom har vært foreslått å øke lokal biomekanisk stress og bidra til plakk ruptur. 53,54 Mediale forkalkning konsekvenser kliniske resultater ved å øke arteriell stivhet, som kan forårsake hjertehypertrofi og påvirke hjertefunksjon. 55 Derfor forstå de m…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB and TET), the Howard Hughes Medical Institute (TM), the Ladue Memorial Fellowship Award from Harvard Medical School (DKR), the START-Program of the Faculty of Medicine at RWTH Aachen (MD), the German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), the National Eye Institute (R01EY022746, ESB), the Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signaling in the Pathogenesis of Pulmonary and Systemic Vascular Diseases, PBY, KDB, and DBB), the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01AR057374, PBY), the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK082971, KDB and DBB), the American Heart Association Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM), and the National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL114805 and R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).
15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
30 G needle | BD | 305106 | |
Alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | SAB2500963 | |
Chamber slide | Nunc Lab-Tek | 154461 | |
Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004176 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-084 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium | Gibco | 14190-144 | |
Elastase | Sigma | E1250 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
Forceps, fine point | Roboz | RS-4972 | |
Forceps, full curve serrated | Roboz | RS-5138 | |
Formalin (10%) | Electron Microscopy Sciences | 15740 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
Human coronary artery smooth muscle cells | PromoCell | C-12511 | |
Insulin syringe with needle | Terumo | SS30M2913 | |
L-ascorbic acid | Sigma | A-7506 | |
Micro-dissecting spring scissors (13mm) | Roboz | RS-5676 | |
Micro-dissecting spring scissors (3mm) | Roboz | RS-5610 | |
NIR, cathepsin (ProSense-750EX) | Perkin Elmer | NEV10001EX | |
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
Normal Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
Nuclear fast red | Sigma-Aldrich | N3020 | |
Odyssey Imaging System | Li-Cor | Odyssey 3.0 | |
Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
Silver nitrate (5%) | Ricca Chemical Company | 6828-16 | |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
Sodium thiosulfate | Sigma | S-1648 | |
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma | G9422 | |
Tissue culture flask, 25 cm2 | Falcon | 353108 | |
Tissue culture plate (35mm x 10mm) | Falcon | 353001 | |
Tissue culture plate, six-well | Falcon | 353046 | |
Trypsin | Corning | 25-053-CI | |
Tube rodent holder | Kent Scientific | RSTR551 | |
Vacuum-driven filtration system | Millipore | SCGP00525 |