Forkalkning av vaskulære glatte muskelceller og avbildning av Aorta forkalkninger og betennelser

Summary

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Abstract

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Introduction

Hjerte- og karsykdommer er den ledende årsak til sykelighet og dødelighet i verden, inkludert USA, hvor det står for mer enn 780 000 dødsfall årlig. ¹ Koronar forkalkning og aortic forkalkning er kjennetegnene ved aterosklerotisk sykdom og tjene som sterke prediktorer for kardiovaskulære hendelser. ^{2- 4} To hovedtyper av vaskulære forkalkning er rapportert hos voksne: intima forkalkning, assosiert med aterosklerose, og medial (også kjent som Monckeberg) forkalkning, assosiert med kronisk nyresykdom og diabetes ⁵ intimaoverflaten forkalkning oppstår i innstillingen av lipid akkumulering og makrofag. infiltrasjon i åreveggen. ^5,6 Medial vegg forkalkning oppstår uavhengig av intima forkalkning, lokaliserer til elastin fiber eller glatte muskelceller, og er ikke forbundet med lipid deponering eller makrofag infiltrasjon. ^5,7,8 studier på de molekylære mekanismervaskulær forkalkninger har stolt på cellebasert og dyremodellsystemer. Gnagermodeller for atherocalcific sykdom inkluderer mus som mangler enten apolipoprotein E (ApoE) ^9,10 eller low-density lipoprotein reseptor (LDLR) ¹¹ matet en fettrik diett, mens modeller for medial forkalkning inkluderer mus med matrix Gla protein (MGP) mangel ¹² eller rotter som utvikler uremia enten ved nær total nefrektomi (5 / sjette nefrektomi modell), eller ved eksponering for en høy-adenin diett. ¹³

Her er modellen av mediale vaskulær forkalkning i forbindelse med MGP mangel fokusert på. MGP er et ekstracellulært protein som inhiberer arteriell forkalkninger. ¹² Mutasjoner i MGP-genet er blitt identifisert i Keutel syndrom, en sjelden human sykdom karakterisert ved diffus brusk forkalkning i tillegg til brachytelephalangy, hørselstap, og perifere pulmonalstenose. ^14-18 Selv om det ikke er ofte observert, ¹⁹konsentriske forkalkning av flere arterier har blitt beskrevet i Keutel syndrom. ²⁰ Felles polymorfismer i menneske MGP-genet er assosiert med økt risiko for koronar forkalkning, ^21-23 mens høyere sirkulerende nivåer av uncarboxylated, biologisk inaktivt MGP forutsi kardiovaskulær dødelighet. ²⁴ I motsetning til mennesker med Keutel syndrom, MGP-mangelfull mus utvikler en alvorlig vaskulær fenotype som består av spontan utbredt arteriell forkalkning starter på to uker gamle og dør 6-8 uker etter fødselen på grunn av aorta ruptur. ¹²

I motsetning til ApoE ^{– / –} og LDLR ^{– / –} mus foret med en fettrik diett, som utvikles intimal vaskulær forkalkning med tilhørende makrofag-indusert inflammasjon, MGP ^{– / -.} Mus utvikler medial vaskulær forkalkning i fravær av makrofagin ^11,25 Selv disse funnene tyder ulike underliggende stimuli for intimal og medial forkalkning, det er overlapping i signalmekanismer som formidler begge former for forkalkninger. ²⁶ flere signalveier har blitt identifisert som bidrar til vaskulær forkalkninger inkludert inflammatoriske mediatorer som tumornekrosefaktor-α og IL-1 og pro-osteogene faktorer såsom hakk, Wnt, og benmorfogenetisk protein (BMP) signalering. ^27,28 Disse signalveier øke ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer runt relaterte transkripsjonsfaktor 2 (Runx2) og osterix, som i sin tur øker ekspresjon av ben-relaterte proteiner ( . f.eks osteocalcin, sclerostin, og alkalisk fosfatase) i blodkar som megle forkalkning ^28-30 Vi og andre har vist at den vaskulære forkalkning observert i ApoE ^{– / –} og LDLR ^{– / –} mus matet en fettrik diett og spontan vaskulære forkalkning observert i MGP ^{– / –} mus alt avhenge benmorfogenetisk protein (BMP) signaling, og det er denne reaksjonsvei som er fokusert på her. ^11,25,31 BMP er potente osteogene faktorer som kreves for bendannelse og er kjent for å utvise økt ekspresjon i humane aterosklerose. ^32-34 In vitro-studier har innblandet BMP signalering i regulering ekspresjon av osteogene faktorer som Runx2. ^35-37 Overekspresjon av BMP-ligand, BMP-2, akselererer utviklingen av vaskulær forkalkning i ApoE-mangelfulle mus foret med en diett med høyt fettinnhold. ³⁸ Videre, ved bruk av spesifikke BMP signale inhibitorer slike som LDN-193189 (LDN) ^39,40 og / eller ALK3-Fc hindrer utvikling av vaskulære forkalkning i begge LDLR ^{– / –} mus matet en fettrik diett og MGP-mangelfull mus ^11,25.

Vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) har en avgjørende rolle i utviklingen av vaskulær forkalkninger. ^30,41,42 Den mediale vaskulære forkalkning som utvikler seg i MGP-mangelfull mus er karakterisertsert av en transdifferensiering av VSMCs til en osteogene fenotype. Tap av MGP resulterer i redusert uttrykk for VSMC markører inkludert myocardin og alfa glatt muskulatur aktin, med en samtidig økning i osteogene markører som Runx2 og osteopontin. Disse endringene faller sammen med utviklingen av vaskulær forkalkning. ^25,43,44

Aorta forkalkninger og betennelser i mus er vanligvis vurderes å benytte histochemical teknikker som alkalisk fosfatase aktivitet for tidlig forkalkning og osteogene aktivitet, von Kossa og Alizarin rød farging for sent forkalkning, og immunhistokjemiske protokoller som er rettet mot makroproteinmarkører (f.eks., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). ^9,45 imidlertid har disse vanlige avbildningsteknikker krever behandling av aortisk vev i tverrsnitt, noe som er tidkrevende og ufullkommen på grunn av skjevhet prøvetaking, og er begrenset i sin evne til å kvantifisere betennelse og calcification i hele aorta. Denne protokollen beskriver en metode for å visualisere og kvantifisere hele aorta og mellomstore arteriell kalsifisering og makrofag-akkumuler anvendelse av nær-infrarødt, fluorescent (NIR) molekylær avbildning ex vivo. Også tilveiebrakt er en fremgangsmåte for høsting og dyrking av primære aorta VSMCs fra mus og indusere forkalkning av murine og humane VSMCs in vitro for å bestemme de molekylære mekanismer som ligger til grunn for vaskulær forkalkning. Disse teknikker gir undersøkeren med både in vivo og in vitro metoder for å studere atherocalcific sykdom.

Protocol

Alle studier med mus ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Bolig og alle prosedyrer som involverer mus som er beskrevet i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og Bruk komiteer ved Massachusetts General Hospital (Subcommittee på forskning Animal Care). Alle prosedyrer ble utført med forsiktighet for å minimalisere lidelse. 1. Utarbeidelse av reagenser Nær-infrarød Fluorescens Imagi…

Representative Results

Aorta forkalkning i MGP – / – og villtype-mus ble målt ved hjelp av billeddannelse av kalsium NIR fluorescens. Ingen kalsium- NIR signal ble detektert i aortaer fra villtype-mus, noe som indikerer fravær av forkalkning (figur 2). En sterk kalsium NIR-signal ble detektert i aortaer fra MGP-manglende mus, noe som er konsistent med avansert vaskulær forkalkning. Vevssnitt av Aorta fra villtype og MGP – / – mus ble farget med Alizarin rød 25</s…

Discussion

Arteriell forkalkning er en viktig risikofaktor for kardiovaskulær sykdom hos mennesker og kan bidra direkte til patogenesen av kardiovaskulære hendelser. ^1,5,52 intima kalsium deponering i tynne fiber caps av aterosklerotisk sykdom har vært foreslått å øke lokal biomekanisk stress og bidra til plakk ruptur. ^53,54 Mediale forkalkning konsekvenser kliniske resultater ved å øke arteriell stivhet, som kan forårsake hjertehypertrofi og påvirke hjertefunksjon. ⁵⁵ Derfor forstå de m…

Materials

15 ml conical tube	Falcon	352096
30 G needle	BD	305106
Alpha smooth muscle actin antibody	Sigma	SAB2500963
Chamber slide	Nunc Lab-Tek	154461
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004176
Dexamethasone	Sigma	D4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium	Gibco	14190-144
Elastase	Sigma	E1250
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
Forceps, fine point	Roboz	RS-4972
Forceps, full curve serrated	Roboz	RS-5138
Formalin (10%)	Electron Microscopy Sciences	15740
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
Human coronary artery smooth muscle cells	PromoCell	C-12511
Insulin syringe with needle	Terumo	SS30M2913
L-ascorbic acid	Sigma	A-7506
Micro-dissecting spring scissors (13mm)	Roboz	RS-5676
Micro-dissecting spring scissors (3mm)	Roboz	RS-5610
NIR, cathepsin (ProSense-750EX)	Perkin Elmer	NEV10001EX
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX)	Perkin Elmer	NEV10020EX
Normal Saline	Hospira	0409-4888-10
Nuclear fast red	Sigma-Aldrich	N3020
Odyssey Imaging System	Li-Cor	Odyssey 3.0
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-001-CI
Silver nitrate (5%)	Ricca Chemical Company	6828-16
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S-9390
Sodium thiosulfate	Sigma	S-1648
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma	G9422
Tissue culture flask, 25 cm2	Falcon	353108
Tissue culture plate (35mm x 10mm)	Falcon	353001
Tissue culture plate, six-well	Falcon	353046
Trypsin	Corning	25-053-CI
Tube rodent holder	Kent Scientific	RSTR551
Vacuum-driven filtration system	Millipore	SCGP00525