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Génération de microtumeurs Utilisation 3D Biogel humain Système de culture et les cellules de glioblastome patients dérivés pour Kinomic Profilage et Testing Réponse Drug

Published: June 9, 2016 doi: 10.3791/54026

Ashley N. Gilbert¹, Rachael S. Shevin⁴, Joshua C. Anderson², Catherine P. Langford³, Nicholas Eustace², G. Yancey Gillespie³, Raj Singh⁴, Christopher D. Willey²

¹Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, ²Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham, ³Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, ⁴Vivo Biosciences, Inc.

Introduction

Les tumeurs les plus courantes primaires intracrâniennes cérébrales malignes sont de grade III et astrocytomes de grade IV glioblastome (glioblastome ou GBM). Ces tumeurs offrent un mauvais pronostic avec la médiane de survie d' un an entre 12 - 15 mois avec les thérapies actuelles pour GBM aux États - Unis ^1-3. multimodales thérapies comprennent la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, y compris le témozolomide (TMZ) et les agents de la kinase ciblée. la signalisation de la kinase est souvent dérégulé dans la GBM, y compris les sous-ensembles de tumeurs avec une amplification ou des mutations d'activation de la croissance du récepteur du facteur épidermique (EGFR), l'augmentation du Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) de signalisation, l'augmentation de phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K), et tumeur supportant une signalisation à travers l' endothélium vasculaire angiogénique Growth Factor Receptor (VEGFR), ainsi que d' autres kinases entraîné voies ^4-6. Current in vitro et in vivo dans des modèles perdent souvent ces altérations représentatives <sup> 7. En outre, le profilage génétique n'a pas offert les avantages escomptés qui peuvent refléter le fait que les changements génétiques et épigénétiques ne prédisent pas toujours des changements au niveau de l'activité de la protéine, où la plupart kinase agents de ciblage agissent directement, et où les thérapies avec d'autres mécanismes d'action peuvent agir indirectement.

La ligne traditionnelle de cellules immortalisées qui peut être repiqué ad infinitum a longtemps été la norme pour le dépistage des drogues en raison de leur facilité d'entretien et de reproductibilité. Toutefois, ce modèle souffre d'un environnement de croissance élevé en éléments nutritifs (et artificielle) qui sélectionne les cellules qui diffèrent grandement de la tumeur d'origine en croissance rapide. En tant que tel, il y a eu un intérêt considérable dans le développement de systèmes de modèles plus réalistes qui reflètent un système biologique de la tumeur plus complexe est présent chez le patient. xénogreffes de tumeurs développées directement à partir d'une tumeur primaire développée chez la souris ( "xenoline" xénogreffe dérivé du patient ou PDX) disposide système modèle plus représentatif, en particulier dans le cadre de traitements contre le cancer, comme ils se font sentir de prédire de manière plus fiable succès clinique. ⁸ Malgré la biologie plus réfléchi, ces modèles sont coûteux et sont difficiles à établir et à maintenir. De plus, ils ne se prêtent pas à des études à haut débit. La nécessité de mieux développer des modèles biologiques qui reflètent plus précisément les altérations moléculaires dans les tumeurs primaires et de profil et tester ces modèles en utilisant des mesures directes de l'activité kinase, pas marqueurs substituts génétiques, est clair.

Il est bien reconnu que , contrairement à deux dimensions (2D) des cultures monocouches, 3D ou modèles d'analyse multicellulaires peuvent fournir plus physiologiquement effets pertinents ^9-11. culture 3D commune approches impliquent des microsupports de matrice revêtu et la formation de sphéroïde cellulaire. sphéroïdes de tumeur peuvent être générés via l'agrégation cellulaire en utilisant ballon rotatif, plaque pHEMA et la pendaison des techniques de chute. Limitations de tapproches es comprennent: l'incapacité de certaines cellules pour former des sphéroïdes stables, la variabilité de la croissance et les défis avec les types de cellules mixtes. Sinon, beaucoup synthétique (hydrogel, polymère) et d' origine animale Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrice à partir de sarcomes de souris, le collagène bovin) matrices ont été développés pour la culture 3D études ^12-14. Matrice de souris EHS est largement utilisée mais connue pour favoriser la croissance et la différenciation cellulaires in vitro et in vivo ^15.

Afin de reproduire la biologie de la tumeur en 3D, un système de biomatrice humain a été développé par le Dr Raj Singh et al. ^16. La libre facteur biogel humain naturel, la croissance permet échafauds de culture 3D (perles, disques), qui soutiennent la culture à long terme de plusieurs types de cellules. Une série de 3D biogel humaine conceptions de la culture sont mis en place pour étudier la croissance tumorale, l'adhérence, l'angiogenèse et l'invasion des propriétés. Avantages et propriétés de biogel humaine par rapport à commungels de souris EHS sont résumés dans le tableau 1 et le tableau 2.

La source:	Amnios humain (tissus Pooled) libre Pathogen, IRB-exemptés / approuvés
Nature ECM:	Non dénaturé Biogel (GLP-production)
Clé Composants:	Col-I (38%), la laminine (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), entactine & HSPG (<3%)
Gratuit GF-:	Indétectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (non-angiogénique, non toxique)

Tableau 1: Propriétés de Biogel humain par rapport à EHS Gels communs.

Biogel humain	gels EHS
Matrice humaine naturelle	Matrice de la souris reconstituée
la croissance et la différenciation cellulaire contrôlée	Peut promouvoir la croissance cellulaire et la différenciation
l'expression du gène Physiologic	l'expression du gène variable
modèle de culture 3D tissus comme	modèle de culture à base Plate-

Tableau 2: Avantages de Biogel humain par rapport à EHS Gels communs.

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Protocol

NOTE: Toutes les évaluations de thérapie xénogreffes ont été effectuées en utilisant un modèle de tumeur orthotopique pour glioblastome sur un protocole approuvé par le Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnels.

1. Isolement des cellules GBM xénogreffes patients dérivés

Préparation des réactifs
1. Reconstituer collagénase I dans de l'eau stérile à une concentration de 5 mg / ml et stérile filtre. Magasin à aliquotes de 1 ml à -20 ° C (la concentration finale est de 50 pg / ml dans 100 ml de solution d'enzyme).
2. Dissoudre 100 pg facteur de croissance épidermique (EGF) dans 2 ml stérile Phosphate-Buffered Saline (PBS). Magasin à 100 ul (5 ug / 100 ul) des aliquotes à -20 ° C pour une concentration finale de 10 ng / ml.
3. Dissoudre 100 pg de FGF-β dans 2 ml de PBS stérile. Magasin à 100 ul (5 ug / 100 ul) des aliquotes à -20 ° C pour une concentration finale de 10 ng / ml.
4. Ajouter la bouteille de Neurobasal Med suivant l'une de 500 mlia (NBM) pour préparer complète NBM: 10 ml B-27 sans supplément de vitamine A, 5 ml supplément N2, 100 pi EGF, 100 pi (facteur de croissance des fibroblastes FGF) -BASIC, 5 ml d'amphotéricine B, 0,5 ml de gentamycine, 5 ml L-glutamine.
5. Préparer une solution fraîche d'enzymes en combinant: 98,5 ml de PBS, 1 ml de collagénase-1, 0,5 ml 10x trypsine / EDTA et stériliser par filtration sur filtre de 0,22 um des pores.
6. Préparer ou obtenir un petit volume stérile du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) / F12 milieu de culture cellulaire avec 7% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 x PBS sans calcium ni magnésium.
tumeur désagrégation
REMARQUE: Les souris athymiques nu / nu préalablement injecté des cellules tumorales dans le flanc droit et autorisé à partir d'une masse tumorale palpable est nécessaire pour cette procédure. Dans les exemples présentés ici, nous avons utilisé des cellules xénogreffes GBM patients dérivés, JX10 et JX12 ^17.
1. Stériliser zone de travail par pulvérisation chlorhexidine à 2% et mis en place la zone de travail d'esprith instruments nécessaires / fournitures , y compris le mandrin jetable, pinces, scalpel, verre boîte de Pétri, solution d'enzyme, PBS, et la chlorhexidine (voir la figure 2A).
2. Euthanasier souris / souris hébergeant une tumeur au flanc. Objectif pour une vitesse de déplacement / min de 20% de CO ₂ en utilisant 30% de CO _2. Après la souris montre un arrêt respiratoire, maintenir CO ₂ flux pendant environ 1 min (typiquement 3 min au total). Les souris sont retirés de la chambre et la dislocation cervicale est réalisée comme une confirmation de l'euthanasie secondaire. Pulvériser l'animal avec 3% de chlorhexidine pour assainir la peau.
3. Tout en maintenant la souris régulière, faire demi-cercle incision de la peau ~ 1,5 cm de la masse tumorale (flanc implanté de tumeur) à l'aide d'un scalpel jetable stérile avec # 11 lame commençant crânienne à la masse de la tumeur et entaillage vers le ventre de la souris et autour de la extrémité caudale.
4. Refléter la peau sur la masse tumorale en utilisant les doigts avec une légère traction sur l'extrémité caudale de l'incision, puis appuyez sur la peausurface pour élever la tumeur d'avoir le meilleur accès sans toucher la tumeur (voir la figure 2B).
5. Utilisez dissection avec une pince à doucement la masse tumorale sans paroi péritonéale et de la peau (voir la figure 2C).
6. masse tumorale de transfert avec une pince à verre stérile boîte de Pétri (NE PAS utiliser des plats en plastique pour éviter la rupture au cours de hachage) et jetez-carcasse et placer ces instruments de côté.
7. Utilisez nouvel ensemble d'instruments stériles (scalpel avec # 11 lame, pince semi-courbes) pour débrider le tissu tumoral du tissu nécrotique et hôte membraneuse tissu conjonctif tumeur couvrant.
8. Placer 15 ml solution enzymatique dans un évent-trypsinisation flacon stérile avec une barre d'agitation et de commencer en remuant lentement dans le capot.
9. Dans un verre boîte de Pétri stérile, laver les tumeurs récoltées 3 - 5 fois avec du PBS stérile pour éliminer l'excès de sang (peut verser ou utiliser une seringue pour les rincer avec le PBS). Inclinez doucement plat et pipette ou aspirer le matériau de lavage. Hacher finely en utilisant deux lames # 11 de scalpel (voir la figure 2D).
10. Ajouter 14 ml de solution d'enzyme à une tumeur hachée et pipeter doucement vers le haut et vers le bas 2 - 3 fois. Transférer le mélange aéré-trypsinisation flacon et agiter doucement pendant 20 min. Préparer 5 50 tubes coniques ml en ajoutant 1,5 ml de FBS à chaque afin de neutraliser la trypsine dans l'étape 01.02.11.
11. Au bout de 20 mn, recueillir 14 ml de solution de cellules de ballon trypsinisation et ajouter à un tube avec du FBS. Ajouter une solution enzymatique 14 ml frais dans le ballon et continuer l'agitation.
12. Centrifugeuse recueilli les cellules à 150 g pendant 8 min à température ambiante et jeter le surnageant. Ajouter 45 ml de NBM complète au culot, mélanger doucement et répétez centrifugation pour rincer sérum. Re-suspendre le culot dans 5ml NBM complète et maintenez sur la glace.
13. étapes de récolte de cellules répétées pour un total de 5 récoltes, combinant toutes les cellules récoltées dans un tube conique unique sur la glace.
14. Placer un tamis cellulaire de 40 pm sur la partie supérieure d'un tube conique de 50 ml. Prep til tamis cellulaire en passant de 10 ml de DMEM / F12 + 7% de FBS à travers et puis lavage avec 10 ml de PBS.
15. Ajouter lentement la suspension cellulaire à la crépine, ce qui permet dégoutte à travers (voir la figure 2 M). Soulevez délicatement l'onglet de la crépine de cellules entre chaque nouvelle addition à briser tout vide et laisser les cellules en suspension de passer librement (voir la figure 2N).
16. Centrifuger la suspension cellulaire filtré comme ci-dessus. Re-suspendre dans 10 ml complète NBM et compter pour déterminer le nombre total de cellules viables en utilisant 0,04% de bleu trypan et un hémocytomètre. Tenir les cellules sur la glace jusqu'à ce que la génération de microtumor.

2. Tissue Alternate Protocole Désagrégation

Automated dissociateur des tissus et le système de ventilation.
1. Placer le tube de ventilation dans le dissociateur cellulaire, sélectionnez le programme "Tumor _02_02" et appuyez sur Start et courir pour 32 sec. tube de transfert à la coiffe, dans 37 ° C incubateur pendant 40 min.
2. Centrifugeuse suspendue-cellules à 150 g pendant 8 min à température ambiante et jeter le surnageant. Alors que centrifugation des cellules, mettre en place des réactifs pour le traitement de la suspension cellulaire. Ajouter 10 ml NBM sans sérum et suspension doucement triturer.
3. Après centrifugation, obtenir un culot cellulaire contenant ~ 10 - 30 x 10 ⁶ cellules viables (~ 0,3 ml). Re-suspension le culot dans 10 ml NBM sans sérum (voir Figure 2O). Déterminer les cellules viables par dosage d'exclusion (voir étape 3.2.2).

3. Microtumor Generation

Préparation des réactifs
1. Préparer complète NBM comme dans 1.1.4 et préparer neutralisé haute densité biogel humaine (HuBiogel) (HDHG à 3 mg / ml) par protocole interne. biogel similaires matrices peuvent aussi bien être utilisés.
Microtumor Production et Culture
1. Obtenir des cellules PDX fraîchement dissociées que la suspension cellulaire unique complète NBM, sur la glace.
2. Mélanger la cellule suspension avec un volume égal de solution de bleu trypan (0,4% dans du PBS) et d' analyser en utilisant hématimètre pour déterminer le nombre et la viabilité cellulaire par exclusion du bleu Trypan ^18. Retirer le volume nécessaire pour générer 50.000 cellules / microtumor où volume = (50.000 cellules / tumeur * # tumeurs) / (cellules viables compte / 1 ml) et placer dans un nouveau tube conique.
3. Concentrer les cellules par centrifugation à 150 x g pendant 8 min, à la température ambiante. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire avec une solution de HDHG glacée dans un rapport final de 1 cellules partielles en FBS et 4 parties HDHG.
4. Utiliser une pipette électronique multicanaux pour distribuer 10 pi par broche cellulaire HDHG mélange sur une plaque d'acier 96 broches (avec un revêtement hydrophobe) pour générer microtumeurs (2 mm perles contenant chacune 50.000 cellules).
5. Placer des billes à l' intérieur de la tumeur 3D incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% de CO _2, humidifiée) pendant 15 min à gélifier les billes.
6. Après gélification, transférer les microtumeurs (10 μ; L) à une chambre de culture en suspension sur mesure (50 ml) ou une grande boîte de culture de volume (10 cm) contenant complète NBM utilisant la pipette multi-canal électronique et personnalisé pin-appareil.
7. Après 1 - 2 jours dans le tissu incubateur de culture, transférer microtumeurs sur des plaques de culture à 96 puits contenant / puits en utilisant une grande bouche de distribution pipette et effectuer divers protocoles d'essai et d'analyse 50 ul NBM.
Traitement de la toxicomanie et l'entretien des microtumeurs
1. Sélectionnez concentrations finales pour le dépistage des drogues.
  NOTE: Si le médicament a connu une efficacité dans la culture 2D, sélectionnez 2x l'IC ₅₀ comme la concentration de la dose moyenne et sélectionner 3 fois des dilutions en série au- dessus et ci - dessous pour un total de 5 niveaux de dose. Par exemple, si le circuit intégré ₅₀ est de 9 pM pour le médicament dans la culture 2D, sélectionner 2 uM, 6 uM, 18 uM, 54 uM et 162 uM comme concentration finale pour le dépistage des drogues.
2. Préparer 2x solution médicamenteuse de dosage en complète NBM de diméthyle sulfoxide (DMSO) stock. Diluer la solution de dosage dans le milieu de DMSO 1% pour préparer une 5 dose, dilution en série 3 fois.
3. Ajouter 50 ul de solution de dosage à l'microtumor puits contenant 50 ul dans des plaques d'essai pour obtenir une concentration finale en DMSO de 0,5%. Répétez l' opération pour chaque répétition (par exemple, 4) à chaque dose de médicament déterminé 3.3.1.
4. Maintenir les cultures à 37 ° C, 5% de CO _2, humidifié culture tissulaire incubateur pour 1 - 14 jours. cultures deux fois par semaine en actualisant les médias et la solution de médicament comme ci-dessus nourrir.

4. Morphologique et Analyse phénotypique des microtumeurs

Déterminer la morphologie des cellules dans microtumeurs en utilisant une coloration des cellules vivantes standard.
1. Préparer 1 mM de calcéine-AM dans le DMSO. Aliquoter et conserver à -20 ° C.
2. A des intervalles de culture désirées (1, 7 et 14 jours), ajouter la solution calcéine-AM préparée dans du PBS (sans Ca / Mg) à la plaque de 96 puits pour 1 pM concentration finale.
3. Incuber20 min dans un 37 ° C, 5% de CO _2, incubateur humidifié, et de l' image en utilisant un microscope à fluorescence à 2X, 4X et 10X (excitation: 450-490 nm passe-bande, émission: 515 nm passe long, dichroïque 500 nm) .
Microtumor Croissance / Essai de prolifération
1. Dissoudre la poudre de MTT dans du PBS (sans Ca / Mg) pour préparer 12 mM. Filtre stérile, aliquote et conserver à -20 ° C.
2. À des intervalles désirés de culture (1, 7 et 14 jours), ajouter 20 pl de solution de MTT à plaque à 96 puits pour un volume de 100 ul de la culture. Incuber pendant 2 heures dans une culture tissulaire incubateur.
3. Préparer la solution de lyse fraîche de SDS à 10% dans HCl 0,01 M et ajouter le montant égal au volume de culture sur des plaques. Incuber les plaques scellées nuit à 37 ° C incubateur.
4. Lire l'absorbance à 570 nm en utilisant un lecteur multi-plaque.
Microtumor Préparation de l'analyse Kinomic
1. Préparer un tampon de lyse par un pré-refroidissement à 4 ° C, puis en ajoutant un rapport 1: 100 de chaque 100x Protein Phosphatase Inhibitor (PPI) et 100x Protein Inhibiteur de protéase (PI). Bien mélanger et garder sur la glace.
2. Transfert 2 microtumeurs à chacun des trois tube de 1,5 ml microcentrifugeuse. Retirer le surnageant et ajouter 40 ul de tampon de lyse contenant de l'IPP et PI à chaque tube et lyser pendant 30 min à 4 ° C.
3. échantillons Pipette vigoureusement pour briser perles tumorales. Centrifugeuse à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C des échantillons et conserver à -80 ° C jusqu'à l'analyse kinomic.

5. Kinomic profilage des microtumeurs

Protein Tyrosine Kinase (PTK) profilage
1. Réactifs décongeler (10x Protein Kinase (PK) tampon et 2% de sérum albumine bovine (BSA)) à 4 ° tampon C Charge PK (300 ul 10x PK stock tampon dans 2,7 ml de dH ₂ O) dans la seringue en position n ° 2 sur le profilage Plate-forme.
2. Ouvrez le logiciel de dosage de kinase et de charger le fichier de protocole PTK et appuyez sur "START", annoter échantillons dans softwsont programme après puces de numérisation. Placez les jetons SUR DES plate-forme de profilage et de la charge 25 pi de 2% de sérum albumine bovine (BSA) par baie, puis appuyez sur LOAD pour lancer le protocole logiciel contrôlé étape de blocage.
3. Diluer 6 uM de 100 mM d' ATP disponible avec 54 ul dH ₂ O pour faire 10 mM d'adénosine triphosphate (ATP). Lorsque le logiciel commence le 3 ^ème, et l' étape de lavage final (visible sur l' écran) apportent 15 pg de lysat amené jusqu'à 28 pi avec dH ₂ O, mélanger et ajouter au tableau.
4. Préparer PTK mélange maître (MM) (pour un maximum de 12 échantillons). Ajouter 32,6 ul _dH2Û pour reconstituer le dithiothréitol (DTT) et d' ajouter 6 ul de DTT et 60 pl 10x PK solution, PTK-MM1 tube (contenant déjà 60 ul de 10 x BSA).
5. Attendez jusqu'à ce que 'Load' invite dans le logiciel d'analyse de kinase apparaît puis ajouter 126 ul de PTK-MM1, additif PTK 60 pi et 60 pi de 10 mM d'ATP à MM2 (contient précédemment aliquoté 4,5 ul d'anticorps PY20 FITC) et mélanger.Ajouter 16 ul de ce maître mix PTK à chaque tube de lysat échantillon et pipette mélange 5 fois.
6. Assurez-verre de couverture est propre, puis ajouter 35 ul lysat / master mix par baie, fermer le couvercle du carrousel, et appuyez sur la touche LOAD.
Sérine / thréonine kinases (STK) Profilage:
1. réactifs décongeler (10x tampon PK, 10x STK tampon, et 2% de BSA) à 4 ° C. Tampon de charge PK (300 pl dans 2,7 ml dH ₂ 0) en position de seringue n ° 1, et un tampon 01:10 STK (300 pl dans 2,7 ml dH ₂ 0) en position de seringue 2 #.
2. Ouvrez le logiciel de l'ordinateur de dosage de kinase et de charger le fichier de protocole STK et appuyez sur START, annoter des échantillons dans le programme après puces de numérisation. Placez les jetons SUR DES plate-forme de profilage et de la charge 25 pi de BSA à 2% par baie, puis appuyez sur LOAD pour commencer le protocole étape de blocage commandé par logiciel.
3. Diluer 6 uM de ATP 100 mM avec 54 ul dH ₂ O. Pendant final (3 ^ème) étape de lavage mélange2 pg de lysat et de mettre à 32,6 pi avec dH ₂ O, mélanger et ajouter au tableau.
4. Faire STK master mix: Ajouter 70 ul 10x PK à STK-MM1 tube (contient 7 pi 100x BSA), puis ajouter 42 ul dH ₂ O à STK-MM1 tube.
5. Attendez jusqu'à ce que 'Load' invite dans le logiciel d'analyse de kinase alors: Ajouter 18 pi 10 mM ATP pour STK-MM1, et ajouter 9 pi MM1 à chaque échantillon lysat. Bien mélanger.
6. Assurez-verre de couverture est propre et ajouter 35 ul lysat / master mix par baie, fermer le couvercle du carrousel, et appuyez sur LOAD.
7. Au cours final (3 ^ème) Wash Etape ajouter un anticorps secondaire 1,05 ul STK-FITC à tube de DMAB (contient 3,03 ul STK mélange d'anticorps primaire), ajouter 39,6 ul AB tampon à DMAB, ajouter 356,0 ul dH ₂ O à DMAB, ajouter 30 pi à DMAB à chaque tableau, et appuyez sur LOAD .
Analyse des données Kinomic ^19,20
1. logiciel d'analyse ouverte et charger l'image App Analyse. Select dossier d'images contenant des images du tableau entier et code-barres horodatées pour PTK ou STK données, numéro appariés sélectionnez l'article fichier de configuration de réseau (86312 pour PTK et 87102 pour STK), et la charge précédemment générées réseau annotation de fichiers.
2. Vérifiez gridding correcte de toutes les images, et exécuter l'exposition Time Scaling App. Comparer statistiquement log2 transformé les valeurs d' exposition / de la pente, et valider avec prélavage courbes cinétiques ^19-21.
3. Exécutez un logiciel de prédiction de kinase en amont pour interroger les profils kinomic modifiées entre les conditions de kinases en amont ^22,23.

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Representative Results

Nous avons montré que le 3D système de culture de Biogel soutient la croissance à long terme et la fonction des types cellulaires multiples. Dans ce projet de collaboration, xenolines de GBM patients dérivés (PDX) sont utilisés pour produire des centaines de microtumeurs. Les cellules dissociées (3 x 10 ⁵⁾ ou des neurosphères (40 - 50) ont été incorporés dans des perles de biogel (2 mm) et après gélification rapide , ils sont mis en culture dans un bioréacteur personnalisé NB-support rempli. La viabilité cellulaire (calcéine-AM), le profil de croissance (MTT), et une analyse basée sur kinomic matrice d'activité ont été déterminées. microtumeurs PDX maintenu organisation multicellulaire et une viabilité élevée (> 80%) pour> 3 semaines. Nous croyons que cette vivo -comme biologie est due à l' entretien de l' architecture 3D cellule-matrice (pas possible avec la 2D ou la culture de sphéroïde). On observe également que les tumeurs 3D sont difficiles à produire avec fragile gélatineuse échafaudage de protéines, peut - être à cause du manque de collagène I ^14. Un plan de travail pour microrotumor production utilisant des cellules PDX et le système de Biogel 3D est résumée à la figure 1 et le procédé de dissociation est représenté sur la figure 2.

Grâce à l'imagerie des cellules vivantes par calcéine-AM, on a déterminé la croissance et la viabilité cellulaire aussi bien que les effets des médicaments sur les cellules de glioblastome dérivées de la tumeur JX10 PDX, comme indiqué par une diminution de la fluorescence, indiquant la mort cellulaire. La croissance tumorale a été mesurée aux jours 0, 7 et 14 pour microtumeurs présentant une croissance continue comme représenté sur la figure 3A. Ce microtumor, JX10, est connu pour être résistant à TMZ. Lorsqu'il est exposé à 1 - 10 pM TMZ, suppression de la croissance a été notée minimale (figure 3B). Cependant, le test tumeur PDX JX12, qui est connu pour être sensible à TMZ, a démontré une sensibilité par un dosage MTT à 14 jours qui a été confirmée par une imagerie calcéine-AM (figure 4).

er.within-page = "1"> Afin d'explorer les mécanismes potentiels de résistance aux médicaments, nous avons mesuré la signalisation de kinase dans les microtumeurs résistants TMZ (JX10). profils Kinomic pour 144 tyrosine et 144 sérine / thréonine cibles phosphopeptides ont été capturés pour DMSO et 10 uM TMZ traités microtumeurs. l'intensité de phosphorylation Kinomic pour toutes les cibles de peptide, par cycle, et par plusieurs temps d'exposition a été capturé (données non présentées). Un représentant heatmap affichant des peptides qui ont sensiblement modifié les intensités avec 10 uM de traitement TMZ (p <0,05, les étudiants non appariés T-test) est affiché sur la figure 5A. Kinomic profils qui ont été modifiées dans le TMZ traités microtumeurs JX10 ont été analysées en utilisant le logiciel de prédiction en amont de la kinase Syk kinase qui a identifié, LCK, CTK et que l' augmentation de TMZ échantillons par rapport à du DMSO (figure 5B) traitée. Analyse sérine / thréonine kinase kinome amont a également été réalisée (Figure 5C).

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Figure 1:. Schéma de travail pour les tumeurs Microtumor production GBM-PDX sont dissociées de l'hôte murin, et des cellules individuelles sont noyées dans une matrice de biogel pour former microtumeurs. Les analyses sont ensuite effectuées sur les microtumeurs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Dissociation. PDX cellules tumorales tumeurs sont prélevées sur des souris hôtes et émincée avant le mélange avec une solution enzymatique (AG). Dissociation apparaît après 40 min (H). Dissociateur des cellules tumorales est représenté (I). La trituration dans les médias et la filtration (JN) est représenté avec un resu finalll de 0,3 ml de culot (O) contenant 29,5 x 10 ⁶ cellules viables (P) qui forment des sphéroïdes NBM en 24 h (Q). La barre d'échelle est de 20 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Croissance des microtumeurs JX10 microtumor croissance mesurée par la densité optique (DO) de MTT et des images représentatives de plus de 14 jours, à la fois vers la base (A), et en réponse à 1-10 uM traitement TMZ (B).. Les images sont affichées à 4X grossissement (barre d'échelle = 500 um). L' écart - type indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. La croissance de microtumeurs JX12 microtumor croissance mesurée par OD de MTT et des images représentatives de plus de 14 jours, à la fois basale (Jour 1), et en réponse à 0, 1 ou 10 uM traitement TMZ (barre d'échelle = 500 pm). L' écart - type indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Profils Kinomic de TMZ microtumeurs traitée Heatmap des valeurs d'exposition intégrée (log2 pentes transformées (x 100) de 10, 20, 50, 100 et 200 ms valeurs médianes d'exposition signal moins d'arrière - plan) sont affichés pour beaucoup TMZ-modifié. des peptides modifiés (p <0,05). Rouge indique une augmentation, et le bleu indique une diminution par rapport au DMSO moyenne par peptide. les profils modifiés TMZ ont été comparés en utilisant le logiciel de prédiction de la kinase en amont et les kinases modifiés. Normalized Kinase statistique (NKS) score> 1.0 et la spécificité score> 1.3 (rouge) sont considérés comme très altérée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Les étapes critiques au sein du protocole portent essentiellement sur microtumor génération, ainsi que dosage des médicaments et de l'entretien. Parce que les perles de microtumor sont fragiles et facilement déchiré, un soin extrême est nécessaire dans les deux stades de développement d'un essai et d'entretien. Si une erreur se produit au cours de l'un de ces procédés, l'interprétation expérimentale peut être compromise, ce qui provoque l'extension ou la répétition inutile des expériences ou même l'exclusion des données.

Modifications et dépannage, en particulier du processus de développement de microtumor, inclus la conception et la production d'un outil hydrophobe personnalisé pour l'utilisation de faire les perles de microtumor. Cet outil permet une production plus rapide et plus précise de microtumeurs. En outre, de petites modifications à l'entretien des microtumeurs ont contribué à accélérer le processus de changement de milieu et de dosage des cellules. Plusieurs de ces modifications comprenaient, mais sans s'y limiter, en utilisant un multicanalpipette électronique pour enlever et remplacer moyen des plaques à 96 puits et de pré-mélange de nouvelles solutions médicamenteuses dosage et l'agencement des solutions de 2x dans une 2 plaque ml 96 puits correspondant.

Principales optimisations pour les conditions de culture dans la modélisation 3D consiste à déterminer les doses appropriées pour des composés médicamenteux, car il y a une relation pauvre entre la modélisation 2D et la modélisation 3D. Par conséquent, des dilutions en série pour établir une courbe de titration de la dose est souvent nécessaire pour déplacer un système de modèle 2D au modèle microtumor 3D.

Les problèmes potentiels à considérer avec la génération de microtumor à partir de cellules tumorales xenoline récoltées à partir d'une souris comprennent la contamination bactérienne ou fongique, la disponibilité irrégulière des xenolines primaires, en tant que propriétés de croissance uniques chez la souris peuvent produire des différences dans le temps de la récolte et de la variance des rendements des cellules de dissociations séparées. Avec chaque lignée cellulaire, le nombre de cellules reçues, et wi est similaire, combien microtumeurs peut être produitll varier. A ce titre, il est nécessaire de donner la priorité à laquelle les tests sont nécessaires et ceux qui sont "en option" si le rendement en microtumor insuffisante. Les limites potentielles avec le profilage kinomic de microtumeurs comprennent la difficulté à corriger pour matériau inerte protéinique chargement, que les échantillons sont chargés de manière à corriger BCA déterminé les niveaux de protéines, qui peuvent ne pas distinguer entre les protéines de biogel base (protéines ECM) et ceux de la composant kinase cellulaire qui est destinée à être mesurée. Mesure de la masse brute microtumor via calcéine-AM, ou en utilisant une protéine de ménage comme un facteur de correction peut atténuer ce, bien que des problèmes avec les niveaux de protéines de ménage dans les tumeurs étant modifiées peuvent confondre cela. Pour peu de temps, bien sûr des expériences de signalisation, en supposant même taille (kinase contenant nombre de cellules vivantes) et lié traités et les échantillons non traités, ce qui est moins un problème.

Avec cette recherche, l'objectif est de fournir un meilleur rapport coût-emodèle préclinique éfficace et maladie représentant pour les tests de traitement médicamenteux précis par rapport aux xénogreffes orthotopique des patients dérivés, le modèle actuel de l'étalon-or pour les tests GBM. Au cours des dernières années, plusieurs groupes ont tenté de modéliser la GBM environnement in vivo à des fins de dépistage de drogues. Certains groupes ont simplement essayé de cultiver des cellules tumorales GBM dans des conditions non-différenciation pour préserver les cellules souches de glioblastome ou de cellules au moins de tumeurs cérébrales initiateur (BTIC) ^24,25. Ces tumorsphere ou neurosphères cultures peuvent être utilisés pour le dépistage des drogues et sont susceptibles supérieure aux modèles traditionnels. Cependant, comme ils manquent encore de l'interaction tumeur stroma qui est conservé dans notre modèle de microtumor, l'approche tumorsphere est encore limitée. D' autres groupes ont tenté d'appliquer des principes d'ingénierie pour améliorer les modèles GBM ^26-28. Ces approches ont inclus des chambres d'écoulement, des protéines ECM variables et cellules tumorales / mélanges de cellules normales. Tout en promettant, la quasi-totalité de ces prises en pensionrts ont utilisé des cellules immortalisées lignes avec les mises en garde mentionnées précédemment. En tant que tel, nous pensons que le modèle de base microtumor-PDX décrit ici est plus cliniquement pertinente.

À l'avenir, le modèle microtumor pourrait être utilisé soit comme un avatar de la tumeur vrai ou un système 'proband'. Avec le système propositus, le PDX développé à partir d'un patient particulier ne renseigne pas directement le clinicien en ce qui concerne le traitement de ce patient spécifique, avec le système de l'avatar de la tumeur. Au lieu de cela, la tumeur d'un patient est "adaptée" à une pré-existante, bien caractérisé ( à la fois moléculairement et phénotypique) PDX ^29. En effet, ce modèle pourrait servir comme un «go-to 'avatar ou de résider dans une bibliothèque proband comme un profil comparatif. Avec avatars traditionnels, la croissance des cellules tumorales d'un patient chez des souris en parallèle au traitement du patient est non seulement beaucoup de temps, car il peut prendre plusieurs mois pour le passage primaire, mais aussi coûteux que de tester plusieurs dthérapies de tapis à souris génèrent une étiquette de prix écrasante. Pour lutter contre cela, la tumeur primaire du patient peut être implanté directement dans la matrice de Biogel. Avec les microtumeurs, les résultats pourraient être générés rapidement et à un moindre coût.

En tant que modèle proband, les profils de données microtumor de Kinome et la réponse aux médicaments pourraient être ajoutés dans un proband «bibliothèque», ainsi que des profils et des données de 3D précédente modèles in vitro, PDXs existants, les études animales, d' autres patients, etc. En théorie, les cellules tumorales du patient pourraient alors être «miquement» (génomiquement, kinomically, transcriptomically, etc.) adapté à un profil similaire de microtumor existant pour déterminer le traitement précis pour le meilleur résultat possible.

Résumé: Ici, nous identifions que ces modèles microtumor peuvent être utilisés pour mesurer à la fois la croissance phénotypique et peuvent être interrogés à la fois au niveau d'activité de la kinase basale et en réponse à un traitement médicamenteux qui peuvent être utilescomme un outil de traduction pour d'autres recherches précliniques. Le développement de modèles testables valides précis et moléculairement pour les tumeurs humaines est impératif pour le développement efficace des médicaments.

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Acknowledgments

Soutenu par subvention du NIH R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), Brain Tumor sentence SPORE (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) et le contrat SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase-I	Sigma-Aldrich	CO130
Trypsin EDTA (10x)	Invitrogen	15400-054
Neurobasal-A	Life Technologies	10888-022
N-2 Supplement	Life Technologies	17502-048	1x final concentration
B-27 Supplement w/o Vitamin A	Life Technologies	12587-010	1x final concentration
Recombinant Human FGF-basic	Life Technologies	PHG0266	10 ng/ml final concentration
Recombinant Human EGF	Life Technologies	PGH0315	10 ng/ml final concentration
L-Glutamine	Corning Cellgro Mediatech	25-005-CI	2 mM final concentration
Fungizone	Omega Scientific	FG-70	2.5 µg/ml final concentration
Penicillin Streptomycin	Omega Scientific	PS-20	100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration
Gentamicin	Life Technologies	15750-060	50 ng/ml final concentration
MTT	Life Technologies	M6494	prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well
SDS	Fisher	BP166	for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well
HCl	Fisher	A144SI-212	for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well
Calcein AM	Life Technologies	C1430	1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail	Pierce ThermoScientific	78420	1:100 ratio in MPER
Halt's Protein Protease Inhibitor	Pierce ThermoScientific	87786	1:100 ratio in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER)	Pierce ThermoScientific	PI78501
Trypan Blue	Pierce ThermoScientific	15250-061
DMSO	Fisher	BP231	for dissolution of calcein AM & compounds
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg	Lonza	17-517Q	diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg	Corning Cellgro Mediatech	20-030-CV	diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash)
10% Neutral Buffered Formalin	Protocol	032-060
Trypan Blue	Pierce ThermoScientific	15250-061
High Density Hubiogel	Vivo Biosciences	HDHG-5
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor	Pierce	78420
Halt's Protein Protease Inhibitor	Pierce	87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER)	Thermo Scientific	78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip	PamGene	86312
PTK kinase buffer	PamGene	36000	300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH₂O, catalog number for PTK reagent kit
ATP	PamGene	36000	catalog number for PTK reagent kit
PY20- FITC-conjugated antibody	PamGene	36000	catalog number for PTK reagent kit
PTK Additive	PamGene	32114
PTK-MM1 tube (10x BSA)	PamGene	36000	catalog number for PTK reagent kit
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip	PamGene	87102
STK kinase buffer	PamGene	32205	catalog number for STK reagent kit
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube)	PamGene	32205	catalog number for STK reagent kit
FITC-conjugated Secondary Antibody	PamGene	32203
STK-MM1 tube (100x BSA)	PamGene	32205	catalog number for STK reagent kit
STK Antibody Buffer	PamGene	32205	catalog number for STK reagent kit
Equipment
#11 Blades, sterile	Fisher	3120030
#3 scalpel handles, sterile	Fisher	08-913-5
100 mm glass Petri dishes	Fisher	08-748D
Semicurved forceps	Fisher	12-460-318
Trypsinizing flask	Fisher	10-042-12B
Magnetic stirrer	Fisher	14-490-200
3/4" stir bar	Fisher	14-512-125
B-D cell strainer	Fisher	#352340
B-D 50 ml Centrifuge tube	Fisher	#352098
PamStation 12	PamGene
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software	PamGene
Evolve Kinase Assay Software	PamGene
UpKin App software (upstream kinase prediction)	PamGene
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-D	with 10 ml disposable HARV

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References

Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. , 7727550 B2 (2010).
Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).

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Gilbert, A. N., Shevin, R. S.,… More

Gilbert, A. N., Shevin, R. S., Anderson, J. C., Langford, C. P., Eustace, N., Gillespie, G. Y., Singh, R., Willey, C. D. Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing. J. Vis. Exp. (112), e54026, doi:10.3791/54026 (2016).

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