العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

Published: June 13, 2016 doi: 10.3791/54036

Ling Li¹, Klaus B. Piontek¹, Vivek Kumbhari¹, Masaharu Ishida², Florin M. Selaru¹

¹Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Department of Surgery, Tohoku University

Abstract

البحث Exosome في السنوات الثلاث الماضية وسعت كثيرا من نطاق نحو تحديد وتوصيف المؤشرات الحيوية واستخداماتها العلاجية.

وقد ثبت Exosomes مؤخرا لاحتواء الرنا الميكروية (ميرس). نشأت ميرس أنفسهم المؤشرات الحيوية القيمة لأغراض التشخيص. كما جمع العينات في العيادات والمستشفيات هو متغير تماما، ميرنا بمعزل عن الصفراء كلها تختلف إلى حد كبير. لتحقيق قوية ودقيقة وقابلة للتكرار الشخصية ميرنا من عينات الصفراء التي تم جمعها بطريقة بسيطة يتطلب وضع بروتوكول ذات جودة عالية لعزل وتوصيف exosomes من الصفراء. وتتطلب هذه الطريقة عدة centrifugations وخطوة الترشيح مع خطوة تنبيذ فائق النهائية لتكوير exosomes معزولة. المجهر الإلكتروني، البقع الغربية، وتدفق الخلوي ومتعددة المعلمة جسيمات متناهية الصغر تحليل البصرية، حيثما كان ذلك متاحا، خطوات حاسمة توصيف للتحقق من جودة هxosomes. لعزل ميرنا من هذه exosomes، ارتفاعه المحللة مع ذلك، ميرنا الاصطناعية غير محدد من الأنواع مثل ايليجانس انواع معينة، أي سل-مير-39، من المهم للتطبيع كفاءة استخراج الحمض النووي الريبي. عزل exosome من السائل المراري التالي هذا الأسلوب يسمح للميرنا ناجحة التنميط من عينات الصفراء تخزينها لعدة سنوات في -80 درجة مئوية.

Introduction

مثل غيرها من السوائل البيولوجية، أي حليب الثدي، البلازما أو البول، والصفراء تحتوي exosomes، الدهون الحويصلات الغنية ^1-4. يمكن Exosomes حمل أو تغيير الوظائف البيولوجية في خلايا المتلقي ^{5، 6،} شكل من أشكال الاتصال خلية خلية التي قد تكون جزءا من وظيفة وضعها الطبيعي ^{4، 7-9.} يمكن أن تحتوي Exosomes الأنواع ميرنا التي يمكن أن توفر مصدرا قيما للالمؤشرات الحيوية للتشخيص ^10. اكتسبت ملامح miRNAs اهتماما كبيرا في السنوات الأخيرة كعلامات التشخيصية والتنبؤية لمجموعة متنوعة من الأمراض ^11-14.

ميرنا نفسها يمكن العثور عليها في السوائل البيولوجية، وربما تفرز من الخلايا الميتة وكمية من الخلايا سقيفة يمكن أن تتأثر بشكل كبير من قبل المرض الأساسي. البيانات الشخصية ميرنا من exosomes لا تعبر بالضرورة عن الشخصية ميرنا الخلية تنشأ ^{6، 10، 15-17،} بعد exosomes قد تحمل تواقيع ميرنا التي قد تكون سمة لم الوالدينليرة لبنانية ترغب في الخلايا السرطانية. وقد تم تحديد exosomes المستمدة من ورم في بلازما المرضى الذين يعانون من السرطان الرئوي وسرطان البروستاتا والأورام الأخرى ^{8 و 16 و 18.}

والهدف من هذه الطريقة هو العزلة متينة وموثوق بها من exosomes من العينات الصفراء الإنسان ومستقلة إلى حد كبير من إجراءات التعامل مع فترة سابقة. وقد تم تطويره لاستخدام الصفراء كمصدر موثوق به من ميرنا لتشخيص محتمل للأمراض القناة الصفراوية مثل سرطان القنوات الصفراوية cholangiocarcinoma ^19. انها تتكون من عدة خطوات الطرد المركزي مع زيادة سرعات لعزل exosomes وقد تكون قابلة للتطبيق على السوائل البيولوجية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الحصول على الصفراء من المرضى عن طريق تصوير البنكرياس بالتنظير الباطني بالطريق الراجع (ERCP) يتطلب الموافقة على بروتوكول الخاضعين للدراسة الإنسان من قبل مجلس المراجعة المؤسسية. وقد وافق جميع الأعمال المعروضة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية جامعة جونز هوبكنز.

1. Exosome عزل من الصفراء

أداء تصوير البنكرياس بالتنظير الباطني بالطريق الراجع (ERCP). وضع المريض في موقف ضعيف وتدخله.
1. تمرير منظار الإثناعشري عن طريق الفم من المريض وأدخله في الجزء الثاني من الاثني عشر والتعرف على حليمة الرئيسية.
2. انتقائي يقني؛ يدخل القنية القناة الصفراوية المشتركة عن طريق إدراج التجويف ثلاثية مبضع المصرة محملة مسبقا مع 0.035 بوصة (0.9 ملم) سلك التوجيه ماء.
3. دفع سلك التوجيه بتوجيه جهاز أشعة للالقناة الكبدية اليسرى منذ أحيانا قد يكون من الصعب التفريق بين القناة المرارية من القناة الكبدية اليمنى، ثم دفعمبضع المصرة 5 سم في القناة الصفراوية للحصول على وضع مستقر.
4. إزالة سلك التوجيه، ونعلق حقنة 10 مل إلى ميناء سلك التوجيه من خلال قفل لور ونضح الصفراوية باستخدام 10 مل من الضغط السلبي.
5. إزالة حقنة تحتوي الصفراء على المضي قدما في ERCP قبل إعادة إدخال سلك التوجيه وحقن عامل تباين عبر ميناء حقن ليعتم الشجرة الصفراوية.
6. نقل الصفراء التي تم جمعها في أنبوب 15 مل على الجليد والحفاظ على الجليد حتى جاهزة للمضي قدما في خطوة الطرد المركزي.
  الحذر: ارتداء القفازات لحماية نفسك والعينات! علاج الصفراء كمصدر محتمل للعدوى لأنها يمكن أن تحتوي على التهاب الكبد A الجسيمات الفيروسية!
7. نأخذ عينة (ق) على الجليد. إما المضي قدما في الخطوة 1.2 أو أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم تجميد في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  ملاحظة: بشكل روتيني استخدمت عينات المخزنة بهذه الطريقة لعدة سنوات مع نتائج جيدة ^19.
8. نقل 400 ميكرولتر من الصفراوية في أنبوب microcentrifuge وجمع الخلايا والحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
9. إزالة طاف قبل pipetting، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge الطازجة وأجهزة الطرد المركزي لعينة (ق) في 16500 x ج لمدة 20 دقيقة أخرى في 4 درجات مئوية لمسح طاف المزيد من الحطام. تجاهل أنابيب في نفايات بيولوجية. بدلا من ذلك، وتدور العينات في نابذة بدلا من ذلك.
10. جمع طاف وتصفية عليه في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مع حقنة من خلال مرشح غشاء 0.2 ميكرون polyethersulfone (PES) التي لديها معدلات تدفق جيدة وانخفاض بروتين ملزمة لإزالة أي جزيئات أكبر من 200 نانومتر نقاط.
11. الماصة وطاف تصفيتها لنابذة الأنابيب وإضافة برنامج تلفزيوني بحيث الأنابيب أكثر من 2/3 كاملة. إذا كانت أنابيب تحتوي على أقل سيولة من ذلك، فإن أنابيب ينهار خلال الطرد المركزي! الأنابيب يمكن غسلها، تعقيمها وإعادة استخدامها عدة مرات.
12. بيلوآخرون في exosomes من خلال تنبيذ فائق في 120000 x ج لمدة 70 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد نظرة الطرد المركزي في الجزء السفلي من أنبوب نابذة لرؤية أحيانا الكريات الصفراء الصغيرة؛ هذه هي exosomes.
13. تجاهل طاف بواسطة الصب بعناية وتطهير النفايات عن طريق إضافة مواد التبييض إلى تركيز النهائي من 10٪ ت / ت والسماح لها الوقوف لمدة 20 دقيقة.
14. للتجارب المصب، إما معالجة بيليه (ق) في حجم صغير من الحل المناسب (أي الترسيب المناعي الشعاعي فحص (المعهد الملكي) العازلة لعزل بروتين، RNA العازلة تحلل لمير العزلة) أو و resuspend في 50-150 ميكرولتر من الفوسفات المالحة (PBS) والتي يمكن تخزينها إما في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل (الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR QRT-) أو استخراج البروتين الخ) أو استخدامها لتوصيف إعداد exosome بواسطة تيم أو التحليل الضوئي جسيمات متناهية الصغر .
2. Exosome تحديد من قبلانتقال المجهر الإلكتروني (تيم) أو CryoEM
1. و resuspend الحويصلات خارج الخلية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل pipetting. من الناحية المثالية، استخدام exosomes التي لم يتم تخزينها في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية، وخاصة عند تنفيذ عزل لأول مرة.
2. كثف قسامة 20 ميكرولتر (حوالي 2 ميكروغرام) إلى 400 Parlodion الشبكات النحاسية المغلفة الكربون يتناغم لمدة 2 دقيقة والسماح ليجف في RT.
3. إصلاح exosome في 1٪ (ت / ت) غلوتارالدهيد (EM-درجة) لمدة 5 دقائق على RT عن طريق وضع قطرات بعناية على إعداد المجففة.
4. غسل شبكات مرتين مع الماء لمدة 5 دقائق ثم النقيض من المركبات الكهربائية وصمة عار مع حمض الفسفوتنغستيك 1٪ (PTA) لمدة 30 ثانية.
5. الحصول على صور باستخدام المجهر الإلكتروني مع الجهد تسارع من 80 كيلو فولت بدأت في تكبير من 20،000X وزيادة ل100،000X عند تحديد حجم الجسيمات.
  ملاحظة: محضرات أخرى مثل طبقات على 200 شبكة النحاس أو النيكل شبكات الكربون المغلفة Formvar ولى النقيض من تلطيخكه 1٪ أو 2٪ خلات اليورانيل لمدة 10-15 دقيقة ممكنة أيضا.
6. لCryoEM، مزيج قسامة 20 ميكرولتر (حوالي 2 ميكروغرام) مع 60 ميكرولتر بروتين G الذهب 10 نانومتر (1: 3 نسبة). وهذا سوف يساعد على تحديد قطرها exosome.
7. نقل العينات على شبكات الكربون هولي C-شقة-تفريغها توهج وإزالة السائل الزائد من قبل النشاف. تجميد الشبكات عن طريق غمس منهم على الفور الى الايثان السائل.
8. تركيب شبكات في cryoholder في النيتروجين السائل.
9. الحصول على الصور بسرعة 200 كيلو فولت مع تكبير من 20،000X و100،000X.
3. Exosome تحديد من متعدد المعلمة جسيمات متناهية الصغر تحليل بصري
1. Resuspend وexosomes معزولة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل pipetting.
2. تمييع exosomes في 600 ميكرولتر PBS في عدة نسب مختلفة (مثل 01:50، 1: 100، 1: 300، 1: 600 و 1: 1200).
3. تصور exosomes بواسطة ضوء الليزر تناثر مع الصك والبرامج المناسبة في الوقت الحقيقي وفقا لMANUFACTUبروتوكول الإندوبلازمية في ^20.
4. زيادة مستوى الكاميرا في وضع الالتقاط حتى تصبح جزيئات مرئية، ثم ضبط التركيز لجعل جزيئات تبدو على نحو سلس.
5. بينما في الوضع العادي، والحد من الكاميرا إلى أدنى مستوى الجزيئات لا يزال ينظر، إذا لزم الأمر ضبط مصراع الكاميرا وتحقيق مكاسب لتحقيق ذلك.
6. فحص البصر لضمان 20-100 جزيئات مرئية على الشاشة، إن لم يكن مسح وحدة وضبط التخفيف في برنامج تلفزيوني.
7. ثم ضبط مدة القبض على ما بين 30-60 ثانية. بعد القبض على الفيديو، وضبط المعلمات المعالجة حتى يتم تحديد جميع الجزيئات التي تظهر على الشاشة ومعالجة ملف الفيديو.
4. Exosome توصيف عن طريق ويسترن وصمة عار
1. ليز exosome الكريات 2-5 مل من الصفراء في 100 ميكرولتر من الجليد الباردة الترسيب المناعي الشعاعي فحص (المعهد الملكي) العازلة مع مثبط البروتياز من قبل pipetting صعودا وهبوطا بدقة وخلط لست] بقوة لمدة 30 ثانيةفي دوامة لإذابة البروتينات بشكل فعال.
2. في حين أن معظم الوقت ليس من الضروري استخدام نبض صوتنة من العينات على الجليد مع 2 البقول لمدة 10 ثانية كل لضمان تحلل كامل.
3. بيليه مواد غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 15000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ونقل طاف لأنبوب نظيفة.
4. تحديد تركيز البروتين مع طريقة الاختيار (أي حمض bicinchoninic (BCA)، Coomassie أو تعديل لوري، 660 نانومتر الفحص البروتين، الخ) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. هذه الطريقة لا يقل أهمية طالما يتم استخدام نفس الأسلوب باستمرار لتحقيق النتائج التي يمكن مقارنتها عبر التجارب.
5. تحميل 50 ميكروغرام من البروتين لكل عينة العازلة في Laemmli بعد تسخين العينة عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في بئر من هلام بولي أكريلاميد لالكهربائي (PAGE).
6. Electrophorese العينات على المواد الهلامية PAGE مقابل 1.5 ساعة ونقل البروتينات فصلها إلى غشاء النايلون.
7. بقفل الغشاء (s) مع الحليب الخالي 5٪ في مخزنة المالحة تريس مع 0.1٪ توين 20 (TBS-T) لمدة 1 ساعة، ثم احتضان مع الأجسام المضادة exosome محددة مثل مكافحة CD63 ومكافحة TSG-101 في التخفيف 1: 500 ويفضل O / N عند 4 درجات مئوية.
8. غسل الأغشية مع TBS-T 3 × 10 دقيقة، ثم احتضان مع الاقتضاء، مطابقة الضد الثانوية HRP-مترافق في الحليب الخالي 5٪ في TBS-T لمدة 1-2 ساعة على RT.
9. غسل غشاء (ق) 3 × 5 دقائق مع TBS-T وكشف بروتينات معينة مع الكواشف التوهج وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
10. صورة الأغشية مع الفيلم أو نظام التصوير الرقمي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
5. الرنا الميكروي عزل من Exosomes متفرقة
ملاحظة: ويتم عزل ميرنا من exosomes الصفراء من استخدام ميرنا العزلة المعدلة على أساس عدة المتاحة تجاريا، ولكن أي طريقة RNA العزلة أخرى يمكن استخدامها أو تكييفها.
1. إضافة 300 &# 181؛ ل تحلل / بناء عازلة لبيليه exosome (معزولة عن 400 الصفراوية ميكرولتر)، دوامة، الماصة أو تمر من خلال إبرة / حقنة لليز تماما exosomes للحصول على المحللة متجانسة.
2. إضافة 1/10 (30 ميكرولتر) حجم ميرنا جناسة المضافة، ومزيج جيد من قبل vortexing أو قلب الأنبوب عدة مرات.
3. احتضان هذا المزيج لمدة 10 دقيقة على الجليد.
4. إضافة حجم حمض الفينول: الكلوروفورم مساويا لجناسة الأولي (300 ميكرولتر).
5. إضافة 5 ميكرولتر من 5 fmol / ميكرولتر سل-مير 39 ودوامة لمدة 30-60 ثانية.
6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10000 x ج في RT لفصل مائي (العلوي) والعضوية (أقل) مراحل.
7. نضح بعناية المرحلة العليا من قبل pipetting ونقل إلى أنبوب جديد مع الإشارة إلى حجم نقل. تجاهل المرحلة العضوية في حاوية النفايات العضوية المناسبة.
8. لإثراء لالرنا صغيرة تضاف 1/3 كمية الإيثانول بنسبة 100٪ إلى المرحلة المائية المستردة وتخلط جيدا قبل vortexing أو للقلب توتكون عدة مرات.
9. الماصة الخليط المحللة / الايثانول على فلتر خرطوشة، وتصل إلى 700 ميكرولتر في وقت واحد.
10. أجهزة الطرد المركزي خراطيش لمدة 15 ثانية في مدة أقصاها 10000 x ج أو تطبيق فراغ لتمرير الخليط من خلال تصفية.
11. جمع الرشاحة وإذا تجاوز خليط المحللة / الإيثانول 700 ميكرولتر، ونقل التدفق من خلال لأنبوب جديد وكرر الإجراء لجمع كل الرواشح. يحتوي على هذه فلتر كسور RNA تخلو من الرنا صغيرة، ويمكن استخدامها لاسترداد هذه الرنا أكبر.
12. إضافة 2/3 حجم RT الإيثانول بنسبة 100٪ في إجمالي الترشيح وتخلط جيدا من قبل vortexing.
13. الماصة الخليط الترشيح / الايثانول على خرطوشة فلتر الثانية. مثل قبل الحد الأقصى لحجم التي يمكن تطبيقها في آن واحد هو 700 ميكرولتر.
14. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 10000 x ج أو تطبيق فراغ كما هو موضح في الخطوة 5.10.
15. تجاهل التدفق من خلال، وكرر حتى كل من خليط الترشيح / الايثانول تم تصفيتها.
16. تطبيق 70081؛ ل ميرنا الحل اغسل 1 إلى خرطوشة الفلتر، الطرد المركزي لمدة 5-10 ثانية أو تطبيق فراغ وتجاهل التدفق من خلال.
17. غسل فلتر مع 500 ميكرولتر غسل الحل 2/3 كما فعلت في الخطوة 5.16.
18. تكرار غسل مرة الثانية مع 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 كما في الخطوة 5.16، تجاهل التدفق من خلال وضع مرشح مرة أخرى في أنبوب جمع.
19. تدور خرطوشة الفلتر لمدة 1 دقيقة في 10000 x ج لإزالة جميع السوائل المتبقية من مرشح.
20. نقل خرطوشة مرشح في أنبوب جمع جديدة وتطبيق 100 ميكرولتر من (95 ° C) المياه nuclease ساخنة مجانية إلى مركز للتصفية.
21. تدور المجالس لمدة 20-30 ثانية في أقصى سرعة لاستعادة الحمض النووي الريبي.
22. جمع شطافة واستخدامها على الفور أو تخزين في -80 درجة مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

منذ exosomes صغيرة جدا بحيث لا يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري العادية أو التدفق الخلوي، المجهر الإلكتروني أو التحليل الضوئي جسيمات متناهية الصغر لابد من القيام بها. التحليل البصري جسيمات متناهية الصغر لديه ميزة على المجهر الإلكتروني أنه هو أيضا الكمي ويوفر حجم التوزيع والتركيز. الصك يدخل شعاع ليزر تركز بدقة من خلال منشور زجاجي في العينة. يتم التقاط الحركة البراونية من الحويصلات معزولة عن طريق EMCCD كاميرا عالية الحساسية وتتبع على أساس الإطار حسب الإطار. تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر (NTA) تدابير البرنامج هذا الاطار الحركة البراونية لتأطير لحساب حجم ووضع وتوزيع الاستعدادات exosome الصفراء. يوضح الشكل (1) ونتيجة لتحليل NTA نموذجية من exosome معزولة من عينة الصفراء الإنسان.

بدلا من ذلك، يمكن استخدام المجهر الإلكترونيللتأكد من حجم الجسيمات المعزولة، وإن كان ذلك دون تقدير. الشكل 2A يظهر عادة نتيجة لانتقال المجهر الإلكتروني لexosome معزولة عن النكد الإنسان.

لمزيد من التحقق من طبيعة exosomal من جزيئات منعزلة، البقع الغربية التحقيق عن وجود البروتينات مثل Tsg101 أو tetraspanin CD63، كما هو موضح في الشكل 2B، لا بد من استخدامها. البروتينات Exosome محددة لا وجود لها في حد ذاتها، ولكن يتم إثراء exosomes في tetraspanins، خصوصا CD9، CD63، CD81 CD82 و CD63 مع وCD81 المشار إليها علامات exosome كما الكلاسيكية، والبروتينات المشاركة في تشكيل exosome مثل TSG101 وأليكس ^21. البروتينات الأخرى مثل الصدمة الحرارية من البروتين المشابهة 70 (Hsc70) و 73 (Hsc73)، وكذلك رئيسي مجمع التوافق النسيجي فئة (MHC) الجزيئات الثاني كما يمكن العثور عليها المخصب في exosomes مع بعض مثل Hsc73 والمحيطي المتواجد غشاء المرتبطةفي الحليب كامل الدسم كرية - عامل نمو البشرة -factor 8 (Mfge8) أن تكون محددة جدا لexosomes يفرز من الخلايا الجذعية ^21.

ويبين الشكل 3 الوقت الحقيقي المؤامرات التضخيم نموذجية من مجموعة متنوعة من الأنواع ميرنا المستخرجة من exosomes الصفراء الإنسان. منذ exosomes، على عكس الخلايا، تفتقر إلى معايير يمكن الاعتماد عليها مثل 18S أو 28S الريباسي أو الجينات التدبير المنزلي مثل GAPDH أو β-الأكتين لتطبيع، وارتفاعه مع ميرنا الاصطناعية هو المهم. يجب أن تستمد ميرنا الاصطناعية من مختلف الأنواع مثل سل-مير 39 من ايليجانس انواع معينة لتمكين احد لتطبيع مستويات التعبير على نحو فعال.

لاستنساخ فمن الأهمية بمكان أن تتم معالجة الصفراء في أقرب وقت ممكن، وليس تجميدها قبل تجهيزها كما تؤدي هذه الظروف إلى تدهور miRNAs موجودة في الصفراء. من ناحية أخرى، معزولة مرة واحدة، exoso MES مستقرة للغاية ومقاومة تماما كما التخزين في RT لمدة 48 ساعة أو ما يصل إلى ثلاث دورات تجميد أذاب تتسبب في آثار تذكر على مستويات اثنين على الأقل نوعا من ميرنا، على الرغم من أن استقرار لميرنا من الفائدة يجب أن تحدد تجريبيا.

شكل 1
الرقم تحليل 1. (الجسيمات النانوية) NTA لتوصيف exosomes المرارية الإنسان كانت مخففة exosomes الصفراء في برنامج تلفزيوني في نسبة 1: 600. (أ) توزيع حجم وتركيز المركبات الكهربائية المعزولة من الصفراء الإنسان. تم تحديد متوسط الحجم إلى أن ما يقرب من 97 نانومتر لهذه العينة (محور س: exosomes الحجم والعمودي: exosomes تركيز لكل حجم). (ب) عينة اطلاق النار الخاطف من نفس العينة التي تم تحليلها في A. نطاق حجم يظهر الحويصلات تتراوح 30-110 نانومتر.= "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. التحقق من طبيعة exosomal إعداد بواسطة نقل المجهر الإلكتروني وصمة عار الغربية. (A) نقل الإلكترون المجهري (تيم) هياكل كروية موجودة في الإنسان الصفراء 70-110 نانومتر في الحجم. شريط المقياس هو 100 نانومتر. (ب) تحليل لطخة غربية من exosomes المرارية يظهر وجود نموذجية البروتينات exosome علامة TSG101 وCD63. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. في الوقت الحقيقي PCR الأنواع ميرنا معزولة عن exosomes الصفراء ريالمتفرغا PCR من مجموعة مير يدل على التضخيم من الأنواع مير متعددة المستخرجة من exosomes الإنسان الصفراوية (محور س، عدد دورة PCR، العمودي، الكثافة النسبية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

للاستفادة موثوق exosomes معزولة عن النكد، فمن المهم استخدام وسائل عالية الجودة بما يتفق العزلة للحصول على عينات عالية الجودة في المقابل. منهجية محددة في هذه الورقة هي وسيلة راسخة لعزل exosomes وميرنا من الصفراء الإنسان. وهو يسلط الضوء على عدد من الخطوات الهامة في توصيف exosomes معزولة التي كحد أدنى يجب أن تشمل المجهر الإلكتروني أو التحليل الضوئي جسيمات متناهية الصغر والبقع الغربية.

الخطوة الأكثر أهمية في عزل exosomes، على الأقل عندما يتعلق الأمر إلى الاستقرار ميرنا، هو لمعالجة الصفراء جديدة في أقرب وقت ممكن. تخزين لفترات طويلة الصفراء بأكملها في RT أو حتى دورة تجميد ذوبان الجليد واحدة يمكن أن تقلل بشكل كبير من المحتوى ميرنا بينما في المقابل exosomes معزولة مستقرة جدا حتى عند تخزينها في RT أو خضوعه لعدة دورات تجميد أذاب. طالما تم تخزين العينات في المسألة في -80 درجة مئوية، والعزلة الناجحة من exosomes وميرNA من الصفراوية يمكن القيام بها مع استنساخ كبير لتحديد التوقيعات ميرنا في العينات. فمن المستحسن أن يبدأ في البداية مع الصفراء جديدة لضمان سلامة ميرنا المناسبة. وهذا هو أحد الاعتبارات الهامة عند محاولة بناء مجموعة من عينات الصفراء مع مرور الوقت كما هو الحال لعينات المرضى. أنه تمكن واحد لمعالجة العينات التي تم جمعها على مدى أشهر أو حتى سنوات لتتم معالجتها وتقييمها في الوقت نفسه.

هذا يعزز بشكل كبير استخدام الصفراء لأغراض التشخيص، إما للبحث عن التوقيعات ميرنا التي تؤكد وجود حالة مرض مثل السرطان أو رد مرض للتدخلات العلاجية. في الواقع، لقد تم استخدام نتائج من العينات السريرية لإنشاء التوقيعات ميرنا والمؤشرات الحيوية للسرطان القنوات الصفراوية cholangiocarcinoma ^19.

الخطوة الأولى الطرد المركزي يزيل خلايا سليمة التي تكون موجودة في الصفراء. في الشوط الثاني، وارتفاع سرعة خلية الطرد المركزي ديبالريس، ومكعبات الهيئات أفكارك وغيرها من العضيات أكبر. للتأكد من أن الجسيمات فقط يتم جمع أقل من 200 نانومتر في خطوة تنبيذ فائق، وخطوة الترشيح مع بروتين منخفض مرشح ملزم هو المهم. بعض البروتوكولات حذفت هذه الخطوة، ولكننا نعتقد أنه من الضروري. بعد تنبيذ فائق في 120000 x ج بيليه الحصول يحتوي exosomes نقية إلى حد ما يمكن أن تكون إما معالجتها فورا أو بعد إعادة تعليق في برنامج تلفزيوني خزنها في -80 درجة مئوية. وجود قيود على هذا الأسلوب هو أن بيليه عليها فقط عالي التخصيب في exosomes ولكن هذا هو الحقيقية لأساليب التخصيب الأخرى مثل استبعاد حجم وهطول الأمطار البوليمر. مزيد من المعالجة قد تترتب خطوة تنقية آخر عن طريق التدرج السكروز أو ملزمة لحبات مغناطيسية المغلفة الأضداد. إذا كان مصدر exosomes (مثل على سبيل المثال البلازما) يحتوي على رواسب نتيجة للتخثر، قد يكون هذا تنقية إضافية عند الضرورة هذه الجسيمات يمكن في كثير من الأحيان يكون حجم exosomes.على وجه الخصوص، لتنقية المناعية تؤدي إلى علامة المخصب إعداد أكثر exosome. العيب هو أن هذا يقلل كذلك كمية من exosomes و / أو ميرنا الوقت الحاضر، وبالنسبة لمعظم أغراض لا يبرر الوقت والعملية تستهلك الموارد. ولكن، إذا تحليل لطخة غربية بالكشف عن وجود تلوث صغرور من خلال بروتين الشبكة الإندوبلازمية مثل calnexin، المزيد من تنقية، وبخاصة المناعية العزلة القائمة، وينصح. في تجربتنا هذا نادرا ما يحدث لالصفراء، وإذا كان أحد يستخدم مصادر أخرى من السوائل البيولوجية سوف أوصى خطوة تنقية القائمة على المناعة.

استخدام تنبيذ فائق التفاضلية لعزل وإثراء exosomes من السائل المراري هو طريقة سريعة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة. في الوقت الذي يتطلب استخدام لنابذة، ويفضل مع البديل الدوار دلو، تم العثور على هذه الأجهزة عادة في العديد من المؤسسات. مزيد من التنقية عن طريق الطرد المركزي الكثافة هي الامكانه مع نفس المعدات والأنابيب وقابلة لإعادة الاستخدام عدة مرات بعد التنظيف والتعقيم. في حين هطول الأمطار البوليمر المستندة يتطلب فقط استخدام microcentrifuges أو أجهزة الطرد المركزي القياسية لتكوير الرواسب بسرعة من 10000 x ج أو أقل، وعموما شارك في عزل الملوثات غير حويصلي بما في ذلك البروتينات الدهنية. بينما البروتينات الدهنية ليست موجودة عادة في الصفراء، وتكلفة البوليمرات غالبا الملكية وبراءة اختراع تجعل العزلة مكلفة مقارنة. هي البوليمرات أيضا يتعارض أحيانا مع التطبيقات المصب مثل مطياف الكتلة، ولكن عندما تحليل المصب متوافق مع البوليمر (RNA أو عزل بروتين)، فإن هذه الطريقة سهلة وسريعة ولا تتطلب معدات معينة.

استبعاد حجم اللوني لديه الجانب السلبي مرات تشغيل طويلة ومتطلبات المعدات الخاصة، ولكن يسمح للفصل الدقيق للجزيئات الكبيرة والصغيرة. تنقية Immunoaffinity غلة أعلى puritذ حويصلات exosomal وحتى يسمح للعزل كسور exosomal محددة مثل الظهارية المشتقة منها، ولكن هذا يأتي على حساب المحصول الكلي. وعلاوة على ذلك، فإنه يقتصر على أحجام عينات صغيرة تتطلب خطوة تخصيب الأولى إذا كمية كبيرة غير لتتم معالجتها وexosomes معزولة قد تفقد النشاط الوظيفي أو تظهر الوظيفة البيولوجية المعدلة بسبب الأجسام المضادة ملزمة.

ومن المهم للنظر في تطبيق المصب (ق) وتوافر المعدات المتخصصة عندما يتعلق الأمر إلى عزل exosomes. توصيف جزيئات منعزلة / أثرى مهم بغض النظر عن طريقة العزل المستخدمة. وقد تنبيذ فائق حتى الآن "المعيار الذهبي" التي يستخدمها العديد من المختبرات بسبب تخصيب قوي وسريع (وإذا كان نابذة متاح فعالة من حيث التكلفة) من الجسيمات exosomal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter	Corning	431229
thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331374
SW40Ti rotor	Beckman Coulter
LM10-HS	Nanosight
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
Complete Protease Inhibitor	Roche distributed by Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).

Cite this Article

Li, L., Piontek, K. B., Kumbhari,… More

Li, L., Piontek, K. B., Kumbhari, V., Ishida, M., Selaru, F. M. Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile. J. Vis. Exp. (112), e54036, doi:10.3791/54036 (2016).

Less

Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions

View Video