Abstract
la ricerca Exosome negli ultimi tre anni ha notevolmente ampliato la portata verso l'identificazione e la caratterizzazione di biomarcatori e loro usi terapeutici.
Esosomi sono stati recentemente dimostrato di contenere microRNA (miR). Mirs si sono sorti come biomarcatori preziosi per scopi diagnostici. Come la raccolta di campioni nelle cliniche e negli ospedali è molto variabile, miRNA isolamento da tutta la bile varia notevolmente. Per ottenere solidi, precisi e riproducibili profili miRNA da campioni di bile raccolti in modo semplice richiesto lo sviluppo di un protocollo di alta qualità per isolare e caratterizzare esosomi dalla bile. Il metodo richiede diversi centrifugazioni e una fase di filtrazione con un passo ultracentrifugazione finale per far sedimentare le esosomi isolati. La microscopia elettronica, Western blot, citometria a flusso e multi-parametro analisi ottica di nanoparticelle, se disponibili, sono passi fondamentali di caratterizzazione per convalidare la qualità del messaggio exosomes. Per l'isolamento di miRNA da questi esosomi, chiodare il lisato con un non-specifica, miRNA sintetico da una specie come Caenorhabditis elegans, vale a dire, Cel-miR-39, è importante per la normalizzazione di efficienza di estrazione di RNA. L'isolamento di exosome dal liquido biliare seguendo questo metodo consente la riuscita miRNA profilatura da campioni di bile conservati per diversi anni a -80 ° C.
Introduction
Come altri fluidi biologici, vale a dire, il latte materno, plasma o urina, la bile contiene esosomi, lipidi vescicole ricche 1-4. Esosomi possono indurre o alterare le funzioni biologiche in cellule riceventi 5, 6, una forma di comunicazione cellula-cellula che potrebbe essere parte della loro normale funzione 4, 7-9. Esosomi possono contenere specie miRNA che possono fornire una preziosa fonte di biomarcatori per la diagnosi 10. profili miRNA hanno guadagnato considerevole attenzione negli ultimi anni come marcatori diagnostici e prognostici per una varietà di malattie 11-14.
miRNA stesso può essere trovato in fluidi biologici, eventualmente rilasciati da cellule morte e la quantità di cellule capannone può essere fortemente influenzato da una malattia di base. Il profilo di miRNA exosomes non riflette necessariamente il profilo miRNA della cellula originaria 6, 10, 15-17, ma exosomes può effettuare firme miRNA che potrebbero essere caratteristico per la ce genitorill come una cellula tumorale. Exosomes tumore-derivato sono stati identificati nel plasma dei pazienti con adenocarcinoma del polmone, cancro alla prostata e di altri tumori 8, 16, 18.
L'obiettivo di questo metodo è l'isolamento affidabile e robusta di esosomi da campioni bile umana, in gran parte indipendenti delle loro procedure di gestione precedenti. E 'stato sviluppato per utilizzare la bile come una fonte affidabile di miRNA per il potenziale diagnosi delle malattie del dotto biliare, come colangiocarcinoma 19. Si compone di diverse fasi di centrifugazione con l'aumentare della velocità per isolare esosomi e potrebbe essere applicabile ad altri fluidi biologici.
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Protocol
Ottenere la bile da pazienti di colangiopancreatografia retrograda endoscopica (ERCP) richiede l'approvazione di un protocollo di studio soggetti umani dal Institutional Review Board. Tutto il lavoro qui presentato è stato approvato dal Comitato Etico della Johns Hopkins University.
1. Exosome Isolamento da Bile
- Eseguire colangiopancreatografia retrograda endoscopica (ERCP). Posizionare il paziente in posizione supina e intubare.
- Passare una duodenoscopio attraverso la bocca del paziente e inserirla nella seconda parte del duodeno e identificare la papilla.
- Selettivamente cannulate il dotto biliare comune con l'inserimento di una tripla lume sfinterotomo pre-caricato con un 0,035 pollici (0,9 mm), filo guida idrofilo.
- Avanzare il filo guida sotto guida fluoroscopica al dotto epatico sinistro in quanto a volte può essere difficile differenziare il dotto cistico dalla dotto epatico destro, poi avanzare ilsfinterotomo 5 cm nel dotto biliare per acquisire una posizione stabile.
- Rimuovere il filo guida, collegare una siringa da 10 ml alla porta filo guida attraverso il blocco Luer e aspirare la bile utilizzando 10 ml di pressione negativa.
- Rimuovere la siringa contenente la bile per procedere con l'ERCP reinserendo il filo guida e iniettando contrasto attraverso la porta di iniezione per opacizzare l'albero biliare.
- Trasferire la bile raccolto in una provetta da 15 ml su ghiaccio e tenere in ghiaccio fino al momento di procedere con la fase di centrifugazione.
Attenzione: Indossare guanti per proteggere se stessi ei campioni! Trattare bile come potenziale fonte di infezione in quanto può contenere epatite A particelle virali! - Mantenere il campione (s) su ghiaccio. O procedere con passo 1.2 o centrifugare a 500 xg a 4 ° C per 10 min e poi congelare a -80 ° C fino all'utilizzo.
Nota: I campioni conservati in questo modo per diversi anni sono stati regolarmente utilizzati con buoni risultati 19. - Transfer 400 ml di bile in una provetta e raccogliere le cellule e detriti cellulari mediante centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante pipettando, trasferire in una provetta fresco e centrifugare il campione (s) a 16.500 xg per altri 20 min a 4 ° C per eliminare il sopranatante di ulteriori detriti. Eliminare i tubi nei rifiuti a rischio biologico. In alternativa, far girare i campioni in un'ultracentrifuga invece.
- Raccogliere il surnatante e filtrare in un armadio biosicurezza con una siringa attraverso un filtro a membrana 0,2 micron polietersulfone (PES), che ha buone portate e basso legame con le proteine per rimuovere eventuali particelle più grandi di 200 nm a sinistra.
- Pipettare il supernatante filtrato per ultracentrifuge tubi e aggiungere PBS modo che i tubi sono più di 2/3. Se i tubi contengono meno liquidi rispetto a quello, i tubi crollerà durante la centrifugazione! I tubi possono essere lavati, sterilizzati in autoclave e riutilizzati più volte.
- Pellet le exosomes attraverso ultracentrifugazione a 120.000 xg per 70 min a 4 ° C. Dopo l'aspetto centrifugazione sul fondo della provetta ultracentrifuga vedere talvolta piccole palline gialle; questi sono gli esosomi.
- Eliminare il surnatante per decantazione cautela e disinfettare rifiuti aggiungendo candeggina per una concentrazione finale del 10% v / v e lasciate riposare per 20 min.
- Per gli esperimenti a valle, o elaborare il pellet (s) in un piccolo volume della soluzione appropriata (ad esempio, test radioimmunoprecipitazione (RIPA) tampone per l'isolamento delle proteine, RNA tampone di lisi per l'isolamento MIR) o risospendere in 50-150 ml di fosfato tamponata salino (PBS), che può essere conservata a -80 ° C per un uso futuro (reale tempo di reazione a catena della polimerasi quantitativa (qRT-PCR) o estrazione delle proteine etc.) o utilizzata per la caratterizzazione del preparato exosome da TEM o analisi ottica nanoparticelle .
2. Identificazione da ExosomeMicroscopia elettronica a trasmissione (TEM) o CryoEM
- Risospendere vescicole extracellulari in 100 ml di PBS pipettando. Idealmente, utilizzare exosomes che non sono stati conservati a -20 ° C o -80 ° C, in particolare quando si esegue l'isolamento per la prima volta.
- Assorbire in 20 microlitri aliquota (circa 2 mg) a 400 griglie di rame Parlodion carbonio rivestite di maglia per 2 minuti e lasciare asciugare a temperatura ambiente.
- Fissare la exosome in 1% (v / v) glutaraldeide (EM-grade) per 5 minuti a RT ponendo attenzione gocce sul preparato secco.
- Lavare le griglie due volte con acqua per 5 minuti e quindi contrastare EVs macchia con acido fosfotungstico 1% (PTA) per 30 sec.
- Acquisire immagini con un microscopio elettronico con una tensione di accelerazione di 80 kilovolt partendo ingrandimenti 20,000X e aumentando al 100,000X per determinare la dimensione delle particelle.
Nota: altre preparazioni come la stratificazione su 200 griglie Formvar carbonio rivestite di maglia di rame o nichel e colorazione di contrasto like 1% o 2% acetato di uranile per 10-15 min sono anche possibili. - Per CryoEM, mescolare un 20 microlitri aliquota (circa 2 mg) con 60 microlitri di proteine G in oro 10 nm (1: 3 ratio). Ciò contribuirà a determinare il diametro exosome.
- Trasferire i campioni su griglie di carbonio bucata C-piatta bagliore-scarica e rimuovere il liquido in eccesso tamponando. Congelare le griglie immergendo immediatamente in etano liquido.
- Montare le griglie in cryoholder in azoto liquido.
- Acquisire le immagini a 200 kV con ingrandimenti di 20,000X e 100,000X.
3. Exosome identificazione da Multi-parametro nanoparticelle analisi ottica
- Risospendere le exosomes isolati in 100 ml di PBS pipettando.
- Diluire exosomes in 600 l di PBS in diversi rapporti diversi (come 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 e 1: 1.200).
- Visualizza le exosomes di scattering di luce laser con lo strumento e software appropriato in tempo reale in base alle Manufactuprotocollo di rer 20.
- Aumentare il livello della fotocamera in modalità di acquisizione fino a quando le particelle diventano visibili, quindi regolare la messa a fuoco per rendere le particelle aspetto liscio.
- Mentre in modalità standard, diminuire la fotocamera al livello più basso che le particelle possono ancora vedere, se necessario regolare otturatore della fotocamera e il guadagno per raggiungere questo obiettivo.
- Controllare visivamente per assicurare 20-100 particelle sono visibili sullo schermo, se non svuotare l'unità e regolare la diluizione in PBS.
- Quindi regolare la durata di acquisizione tra il 30-60 sec. Dopo il video viene catturato, regolare i parametri di elaborazione fino a quando tutte le particelle vengono identificati sullo schermo ed elaborare il file video.
4. Exosome Caratterizzazione mediante Western Blot
- Lyse exosome pellet da 2-5 ml di bile in 100 ml di test radioimmunoprecipitazione ghiacciata (RIPA) tampone con un inibitore della proteasi pipettando su e giù a fondo e mescolare lisati energicamente per 30 secsu un vortex per solubilizzare efficacemente le proteine.
- Mentre la maggior parte del tempo non necessario, utilizzare pulse-sonicazione dei campioni su ghiaccio con 2 impulsi per 10 secondi ciascuna per garantire la piena lisi.
- Pellet materiale insolubile mediante centrifugazione a 15.000 xg a 4 ° C per 5 minuti e trasferire il surnatante in una provetta pulita.
- Determinare la concentrazione di proteine con un metodo di scelta (cioè, acido bicinconinico (BCA), Coomassie, modificato Lowry, 660 nm Protein Assay, ecc) secondo il protocollo del produttore. Il metodo non è importante finché lo stesso metodo viene utilizzato costantemente per ottenere risultati paragonabili attraverso esperimenti.
- Carico 50 mg di proteine per campione in tampone Laemmli dopo riscaldamento del campione a 95 ° C per 5 minuti in un pozzo di un gel di poliacrilammide per elettroforesi (PAGE).
- Elettroforesi i campioni sui gel PAGE per 1,5 ore e trasferire le proteine separate su una membrana di nylon.
- Bbloccare la membrana (s) con il 5% di latte scremato in Tris-Buffered Saline con 0,1% di Tween 20 (TBS-T) per 1 ora, poi incubare con anticorpi specifici exosome come anti-CD63 e anti-STG-101 a una diluizione di 1: 500, preferibilmente O / N a 4 ° C.
- Lavare le membrane con TBS-T 3 x 10 min, poi incubare con un appropriato, corrispondente anticorpo secondario HRP-coniugato in 5% latte scremato in TBS-T per 1-2 ore a temperatura ambiente.
- Lavare la membrana (s) 3 x 5 minuti con TBS-T e rilevare le proteine specifiche con i reagenti chemiluminescenza secondo il protocollo del produttore.
- Immagine le membrane con film o un sistema di imaging digitale secondo il protocollo del produttore.
5. MicroRNA isolamento dal Esosomi isolati
Nota: Isolamento di miRNA da exosomes biliari viene effettuata utilizzando un isolamento miRNA modificata sulla base di un kit disponibile in commercio, ma qualsiasi altro metodo di isolamento di RNA può essere utilizzato o adattato.
- Aggiungere 300 &# 181; l lisi / tampone edificio al pellet exosome (isolato da 400 ml di bile), vortex, pipetta o passare attraverso un ago / siringa per la lisi completamente il esosomi per ottenere un lisato omogeneo.
- Aggiungere 1/10 (30 ml) volume di miRNA Omogenato additivo, e mescolare bene nel vortex o invertendo il tubo più volte.
- Incubare la miscela per 10 min in ghiaccio.
- Aggiungere un volume di acido-fenolo: cloroformio pari al omogenato iniziale (300 ml).
- Aggiungere 5 ml di 5 fmol / ml cel-miR 39 e vortex per 30-60 sec.
- Centrifugare per 5 min a 10.000 xg a temperatura ambiente per separare il acquosa (superiore) e fasi organiche (inferiore).
- aspirare accuratamente la fase superiore pipettando e trasferire in una nuova provetta pur rilevando il volume trasferito. Eliminare la fase organica nel contenitore dei rifiuti organici appropriata.
- Per arricchire per piccoli RNA aggiungere 1/3 del volume di 100% di etanolo alla fase acquosa recuperata e mescolare per bene vortex o invertendo il tuessere diverse volte.
- Pipettare la miscela lisato / etanolo sulla cartuccia del filtro, fino a 700 ml per volta.
- Centrifugare le cartucce per 15 sec a un massimo di 10.000 xg o applicare il vuoto per passare la miscela attraverso il filtro.
- Raccogliere il filtrato e se la miscela lisato / etanolo supera 700 ml, trasferire il flusso continuo in una nuova provetta e ripetere la procedura per raccogliere tutte le filtrati. Questi filtro contiene frazioni di RNA privi di piccoli RNA e può essere utilizzato per recuperare questi RNA più grandi.
- Aggiungere 2/3 volume di RT 100% di etanolo al filtrato totale e mescolare bene nel vortex.
- Pipettare la miscela filtrato / etanolo su una seconda cartuccia filtrante. Come prima il volume massimo che può essere applicato in una sola volta è di 700 microlitri.
- Centrifugare per 15 secondi a 10.000 xg o applicare il vuoto come descritto al punto 5.10.
- Gettare il flow-through, e ripetere fino a quando tutti miscela filtrato / etanolo è stato filtrato.
- applicare 70081; l miRNA soluzione di lavaggio 1 per la cartuccia del filtro, centrifugare per 5-10 secondi o applicare il vuoto e scartare il flow-through.
- Lavare il filtro con 500 microlitri soluzione di lavaggio 2/3 come fatto nella fase 5.16.
- Ripetere il lavaggio una seconda volta con 500 ml di soluzione di lavaggio 2/3 come al punto 5.16, scartare il flow-through e posizionare il filtro nel tubo di raccolta.
- Spin la cartuccia del filtro per 1 min a 10.000 xg per rimuovere tutto il liquido residuo dal filtro.
- Trasferire la cartuccia filtro in un tubo di raccolta fresca e applicare 100 ml di acqua calda libera (95 ° C) nucleasi al centro del filtro.
- Spin assemblee per 20-30 secondi alla massima velocità per recuperare l'RNA.
- Raccoglie l'eluato e utilizzare immediatamente o conservare a -80 ° C.
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Representative Results
Poiché esosomi sono troppo piccole per essere rilevato mediante microscopia normale o la citometria a flusso, microscopia elettronica o analisi ottica nanoparticelle deve essere eseguita. L'analisi ottica nanoparticelle ha il vantaggio rispetto microscopia elettronica che è anche quantitativa e fornisce distribuzione dimensionale e concentrazione. Lo strumento presenta un raggio laser finemente focalizzato attraverso un prisma di vetro nel campione. Il moto browniano delle vescicole isolate viene catturata attraverso una telecamera ad alta sensibilità EMCCD e monitorati su base fotogramma per fotogramma. Le analisi nanoparticelle di inseguimento (NTA) software misura questo telaio moto browniano per inquadrare per calcolare la dimensione, la modalità e la distribuzione delle preparazioni exosome biliari. La figura 1 mostra il risultato di una tipica analisi NTA di exosome isolato da un campione di bile umana.
In alternativa, microscopia elettronica può essere utilizzataper confermare la dimensione delle particelle isolate, pur senza quantificazione. La Figura 2A mostra il tipico risultato della microscopia elettronica a trasmissione per exosome isolato dal bile umana.
Per un'ulteriore verifica della natura exosomal delle particelle isolate, Western blot rilevamento della presenza di proteine come Tsg101 o tetraspanin CD63, mostrate nella Figura 2B, devono essere utilizzati. Non esistono proteine specifiche exosome di per sé, ma esosomi sono arricchiti in tetraspanine, soprattutto CD9, CD63, CD81 e CD82 con CD63 e CD81 denominato marcatori exosome come classici, e le proteine coinvolte nella formazione exosome come Tsg101 e Alix 21. Altre proteine come la proteina heat shock 70 cognate (Hsc70) e 73 (Hsc73), così come le molecole complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II si possono trovare anche arricchito in esosomi con un po 'come Hsc73 e la prote associata alla membrana perifericanel latte del globulo di grasso - fattore di crescita epidermico -factor 8 (Mfge8) essendo abbastanza specifico per esosomi secreti dalle cellule dendritiche 21.
La Figura 3 mostra i tipici grafici di amplificazione in tempo reale di una varietà di specie miRNA estratti da exosomes di bile umana. Dal esosomi, a differenza delle cellule, mancano gli standard affidabili come 18S o 28S rRNA o geni housekeeping come GAPDH o β-actina per la normalizzazione, la chiodare con un miRNA sintetico è importante. I miRNA di sintesi dovrebbero essere derivati da una specie diversa, come cel-miR 39 da Caenorhabditis elegans per consentire un efficace per normalizzare i livelli di espressione.
Per riproducibilità è fondamentale che la bile viene elaborato appena possibile e non congelato prima della trasformazione in queste condizioni portano alla degradazione dei miRNA presenti nella bile. D'altra parte, una volta isolato, exoso mes sono molto stabili e abbastanza resistente da stoccaggio a temperatura ambiente per 48 ore o fino a tre cicli di congelamento-scongelamento causano effetti trascurabili sui livelli di almeno due specie di miRNA, anche se la stabilità del miRNA di interesse deve essere determinato empiricamente.
Figura 1. Analisi (nanoparticelle) NTA per caratterizzare esosomi biliari umani exosomes biliari sono stati diluiti in PBS nel rapporto di 1:. 600. (A) la distribuzione dimensioni e la concentrazione di veicoli elettrici isolati da bile umana. La dimensione media è stata determinata essere di circa 97 nm per questo campione (asse x: esosomi dimensioni, asse y: exosomes concentrazione per ogni dimensione). SNAP (B) Campione colpo dello stesso campione analizzato in A. La gamma di dimensioni mostra vescicole che vanno 30-110 nm.= "_ Blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Verifica della natura exosomal del preparato mediante microscopia elettronica a trasmissione e Western blot. (A) microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di strutture sferiche presenti nella bile umana 70-110 nm dimensioni. barra della scala è di 100 nm. (B) Analisi Western Blot di esosomi biliari mostra la presenza delle tipiche proteine marker exosome Tsg101 e CD63. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Real-time PCR di specie miRNA isolati da exosomes biliari. Reale-time PCR di un array di miR dimostra l'amplificazione di molteplici specie di miR estratti da exosomes umani biliari (asse x, PCR numero di cicli; asse y, intensità relativa). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per utilizzare in modo affidabile esosomi isolati dalla bile, è importante utilizzare metodi di isolamento di alta qualità costante per ottenere campioni di alta qualità in cambio. La metodologia definita in questo documento è un modo consolidato per isolare esosomi e miRNA dalla bile umana. Si evidenzia diversi passaggi cruciali nella caratterizzazione dei esosomi isolati che come minimo dovrebbe comprendere microscopia elettronica o l'analisi ottica di nanoparticelle e macchie occidentali.
Il passo più importante nell'isolamento di esosomi, almeno quando si tratta di stabilità miRNA, è di elaborare bile fresca appena possibile. lo stoccaggio prolungato di tutta la bile a temperatura ambiente o anche un singolo ciclo di congelamento-scongelamento può ridurre significativamente il contenuto di miRNA, mentre al contrario le esosomi isolate sono molto stabili, anche se conservato a temperatura ambiente o sottoposti a diversi cicli di gelo-disgelo. Fino a quando i campioni in questione sono stati conservati a -80 ° C, isolamento successo di esosomi e miRNA da bile può essere eseguita con grande riproducibilità per identificare firme miRNA nei campioni. Si consiglia di iniziare inizialmente con la bile fresca per garantire l'integrità dei miRNA. Questa è una considerazione importante quando si tenta di costruire una raccolta di campioni di bile nel tempo come sarebbe il caso per i campioni dei pazienti. Esso permette di trattare i campioni che sono stati raccolti nel corso di mesi o anche anni per essere trattati e valutati allo stesso tempo.
Ciò aumenta notevolmente l'uso di bile per scopi diagnostici, sia per cercare firme miRNA che confermano la presenza di uno stato di malattia come il cancro o la risposta di una malattia per interventi terapeutici. Infatti, i risultati di campioni clinici sono stati utilizzati per stabilire le firme miRNA come biomarcatori per colangiocarcinoma 19.
La prima fase di centrifugazione rimuove le cellule intatte che sono presenti nella bile. Nel secondo, cella per la centrifugazione velocità superiore debris, corpi apoptotici e altri organelli più grandi sono pellet. Per assicurarsi che le particelle solo più piccolo di 200 nm vengono raccolti nel passo ultracentrifugazione, la filtrazione con una proteina ridotto legame filtro è importante. Alcuni protocolli omettono questo passaggio, ma pensiamo che sia necessario. Dopo l'ultracentrifugazione a 120.000 xg il pellet ottenuto contiene exosomes abbastanza puri che possono sia essere trattati immediatamente o dopo risospensione in PBS essere conservati a -80 ° C. Una limitazione di questo metodo è che il pellet ottenuto è solo altamente arricchito in esosomi ma questo è vero per altri metodi di arricchimento quali l'esclusione dimensioni e precipitazioni polimerico. L'ulteriore trattamento potrebbe comportare un ulteriore passo di purificazione dal gradiente di saccarosio o di legame al sfere magnetiche rivestite di anticorpi. Se la fonte dei exosomes (come per esempio plasma) contiene precipitati a causa di coagulazione, questa purificazione supplementare potrebbe essere necessario in quanto queste particelle possono spesso avere le dimensioni di esosomi.In particolare, l'immuno-purificazione conduce ad una preparazione marcatore arricchito più exosome. Lo svantaggio è che questo riduce ulteriormente la quantità di esosomi e / o miRNA presenti, e per molti scopi non giustifica il tempo e processo che richiede risorse. Se, tuttavia, analisi Western blot rileva la presenza di contaminazione microsome attraverso una proteina reticolo endoplasmatico come calnexin, ulteriore purificazione, in particolare immuno-isolamento base, è consigliato. Nella nostra esperienza, questo è raramente il caso per la bile, se si usano altre fonti di liquidi biologici sarebbe consigliabile una fase di purificazione immuno-based.
L'uso di ultracentrifugazione differenziale per isolare e arricchire esosomi dal liquido bile è un metodo relativamente veloce e conveniente. Mentre richiede l'uso di un'ultracentrifuga, preferibilmente con un rotore dell'oscillazione secchio, questi dispositivi si trovano comunemente in molti istituti. Ulteriore purificazione mediante centrifugazione densità sono possible con la stessa apparecchiatura e le provette sono riutilizzabili più volte dopo la pulitura e sterilizzazione. Mentre precipitazione a base di polimeri richiede solo l'uso di microcentrifughe o centrifughe standard per agglomerare le precipitati alla velocità di 10.000 xg o meno, generalmente co-isolati contaminanti non vescicolari compreso lipoproteine. Mentre lipoproteine non sono generalmente presenti nella bile, il costo dei polimeri spesso proprietarie e brevettate rendono l'isolamento costoso in confronto. I polimeri sono anche talvolta incompatibile con le applicazioni a valle come la spettrometria di massa, ma quando l'analisi valle è compatibile con il polimero (RNA o l'isolamento di proteine), il metodo è semplice, veloce e non richiede attrezzature specifiche.
esclusione Dimensioni cromatografia ha lo svantaggio di tempi di esecuzione lunghi e l'esigenza di attrezzature speciali, ma permette la precisa separazione tra grandi e piccole particelle. purificazione immunoaffinità produce il più alto purity di vescicole exosomal e persino permette l'isolamento di particolari frazioni exosomal come epiteliale derivato, ma questo viene a costo di resa totale. Inoltre, è limitata a piccoli volumi campioni richiedono una prima fase di arricchimento se un grande volume deve essere trattati e le exosomes isolati può perdere attività funzionale o esporre funzione biologica alterata a causa degli anticorpi legati.
È importante considerare l'applicazione a valle (s) e la disponibilità di attrezzature specializzate per quanto riguarda l'isolamento di esosomi. La caratterizzazione delle particelle isolate / arricchito è importante indipendentemente dal metodo di isolamento utilizzato. Ultracentrifugazione finora è stato un "gold standard" utilizzato da molti laboratori per la sua robusta e veloce (e di costo-efficace se un'ultracentrifuga è disponibile) arricchimento di particelle exosomal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
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