Abstract
Exosome forskning i de siste tre årene har sterkt utvidet omfang mot identifisering og karakterisering av biomarkører og deres terapeutiske anvendelser.
Exosomes har nylig vist seg å inneholde microRNAs (Mirs). Mirs selv har oppstått som verdifulle biomarkører for diagnostiske formål. Som prøveinnsamling i klinikker og sykehus er ganske variabel, miRNA isolasjon fra hele galle varierer betydelig. For å oppnå robust, nøyaktige og reproduserbare miRNA profiler fra innsamlede galleprøver på en enkel måte krevde utvikling av en høy kvalitet protokoll for å isolere og karakterisere exosomes fra galle. Metoden krever flere sentrifugeringer og et filtreringstrinn med en endelig ultrasentrifuge trinn å pelletere de isolerte exosomes. Elektronmikroskopi, Western blot, flowcytometri og multi-parameter nanopartikkel optiske analyse, der det er tilgjengelig, er avgjørende karakterisering for å validere kvaliteten på exosomes. For isolering av miRNA fra disse exosomes, skyter lysatet med et ikke-spesifikt, syntetisk miRNA fra en art som Caenorhabditis elegans, dvs. Cel-MIR-39, er viktig for normalisering av RNA-ekstraksjon effektivitet. Isolasjon av exosome fra gallevæske følger denne metoden gjør det vellykkede miRNA profilering fra galle prøver lagret i flere år ved -80 ° C.
Introduction
Som andre biologiske væsker, dvs. morsmelk, plasma eller urin, inneholder galle exosomes, lipid rike vesikler 1-4. Exosomes kan indusere eller endre biologiske funksjoner i mottakercellene 5, 6, en form av celle-celle-kommunikasjon som kan være en del av deres normale funksjon 4, 7-9. Exosomes kan inneholde miRNA arter som kan gi en verdifull kilde til biomarkører for diagnostisering 10. mirnas profiler har fått betydelig oppmerksomhet de siste årene som diagnostiske og prognostiske markører for en rekke sykdommer 11-14.
miRNA selv kan finnes i biologiske væsker, eventuelt utgitt av døde celler og mengden av skur celler kan bli sterkt påvirket av en underliggende sykdom. Den miRNA profilen til exosomes gjenspeiler ikke nødvendigvis miRNA profilen til den opprinnelige cellen 6, 10, 15-17, men exosomes kan bære miRNA signaturer som kan være karakteristisk for foreldre cell liker en svulst celle. Tumor-avledet exosomes er blitt identifisert i plasma hos pasienter med lunge adenokarsinom, prostata kreft og andre tumorer 8, 16, 18.
Målet med denne metoden er pålitelig og robust isolering av exosomes fra menneskelige galle prøver, i stor grad uavhengig av deres tidligere håndteringsprosedyrer. Det ble utviklet for å utnytte galle som en pålitelig kilde for miRNA for den potensielle diagnose av sykdommer i gallegangen som kolangiokarsinom 19. Det består av flere trinn av sentrifugering med økende hastigheter for å isolere exosomes og kan være aktuelt for andre biologiske væsker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Innhenting av galle fra pasienter ved ercp (ERCP) krever godkjenning av et menneskelig fag studieprotokoll av Institutional Review Board. Alt arbeidet som presenteres her ble godkjent av Johns Hopkins University Institutional Review Board.
1. Exosome Isolasjon fra Bile
- Utfør ercp (ERCP). Plasser pasienten i liggende stilling og intubere.
- Passere en duodenoscope gjennom munnen til pasienten og sett den inn i den andre delen av tolvfingertarmen og identifisere de store papilla.
- Selektivt cannulate felles gallegang ved å sette inn en trippel lumen sphincterotome forhåndslastet med en 0,035 tommer (0,9 mm) hydrofil tråden.
- Advance ledetråden under fluoroskopisk veiledning til venstre levergang siden til tider kan det være vanskelig å skille den gallegangs fra høyre levergang, deretter fremmesphincterotome 5 cm inn i gallegangen for å få en stabil posisjon.
- Fjern styretråden, feste en 10 ml sprøyte til styretråden port gjennom Luer-lås og aspireres galle anvendelse av 10 ml av undertrykk.
- Fjern sprøyten inneholder galle å fortsette med ERCP ved sette inn tråden og injisere kontrastmiddel gjennom injeksjonsporten til opacify galletreet.
- Overfør den oppsamlede gallen til et 15 ml rør på is og holder på is inntil de er klare til å fortsette med sentrifugeringstrinn.
Forsiktig: Bruk hansker for å beskytte deg selv og prøvene! Unn galle som en potensiell smittekilde som det kan inneholde Hepatitt A viruspartikler! - Hold prøven (e) på is. Enten fortsette med trinn 1.2 eller sentrifuge ved 500 xg ved 4 ° C i 10 minutter og deretter fryse ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
Merk: Prøver som er lagret på denne måten i flere år har rutinemessig blitt brukt med gode resultater 19. - Overføre 400 ul av galle i et mikrosentrifugerør og samle celler og celleavfall ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten ved pipettering, overføring til en frisk mikrosentrifugerør og sentrifuger prøven (e) ved 16 500 xg i ytterligere 20 minutter ved 4 ° C for å fjerne supernatanten av ytterligere rusk. Kast rørene i biohazard avfall. Alternativt spinne prøvene i en ultrasentrifuge i stedet.
- Samle supernatanten og filtrere det i en biosikkerhet kabinett med en sprøyte, gjennom et 0,2 um polyetersulfon (PES) membranfilter som har gode strømningshastigheter og lav proteinbinding for å fjerne eventuelle partikler som er større enn 200 nm venstre.
- Pipette det filtrerte supernatant til ultrasentrifuge-rør og tilsett PBS, slik at rørene er mer enn 2/3 full. Dersom rørene inneholder mindre væske enn det, vil rørene kollapse under sentrifugering! Rør kan vaskes, autoklaveres og gjenbrukt flere ganger.
- Pellet de exosomes gjennom ultrasentrifugering ved 120 000 xg i 70 min ved 4 ° C. Etter sentrifugering se på bunnen av ultrasentrifugerør å noen ganger se små gule pellets; disse er de exosomes.
- Kast supernatanten ved forsiktig dekantering det og desinfisere avfallet ved tilsetning av blekemiddel til en sluttkonsentrasjon på 10% volum / volum, og la det stå i 20 min.
- For nedstrøms eksperimenter, enten behandle pelleten (e) i et lite volum av den passende oppløsning (dvs. radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer for protein isolert RNA lyseringsbuffer for MIR isolasjon), eller suspendere den i 50 til 150 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) som kan være enten lagret ved -80 ° C for fremtidig bruk (kvantitativt sanntids-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR) eller proteinekstraksjon etc.) eller anvendt for karakterisering av exosome fremstilling av TEM eller nanopartikler optisk analyse .
2. Exosome Identifikasjon avTransmisjonselektronmikroskopi (TEM) eller CryoEM
- Resuspender ekstracellulære vesikler i 100 ul PBS ved pipettering. Bruk helst exosomes som ikke har blitt lagret ved -20 ° C eller -80 ° C, spesielt ved utførelse av isolasjon for første gang.
- Adsorbere en 20 mL delmengde (ca 2 mikrogram) til 400 mesh karbon-belagt Parlodion kobbernett i 2 min og la den tørke i romtemperatur.
- Fest exosome i 1% (v / v) glutaraldehyd (EM-grade) i 5 min ved RT ved å plassere dråper forsiktig på det tørkede preparat.
- Vask ristene to ganger med vann i 5 minutter og deretter kontrast beis el-biler med 1% fosfowolframsyre (PTA) i 30 sek.
- Hente bilder med et elektronmikroskop med en akselerasjonsspenning på 80 kV som starter ved forstørrelse av 20,000X og økende til 100,000X ved fastsettelse av størrelsen av partiklene.
Merk: Andre forbereder som lagdeling på Formvar karbon-belagt 200 mesh kobber eller nikkel nett og kontrast flekker like 1% eller 2% uranylacetat i 10-15 min er også mulig. - For CryoEM, blande en 20 ul alikvot (ca. 2 ug) med 60 ul Protein G gull 10 nm (1: 3-forhold). Dette vil bidra til å fastslå exosome diameter.
- Overfør prøvene på gløden-utladet C-flat holey karbon nett og fjerne overflødig væske av blotting. Fryse nett ved å dyppe dem umiddelbart til flytende etan.
- Monter ristene i en cryoholder i flytende nitrogen.
- Acquire bildene på 200 kV med forstørrelser av 20,000X og 100,000X.
3. Exosome Identifikasjon av Multi-parameter partikler Optical Analysis
- Resuspender de isolerte exosomes i 100 ul PBS ved pipettering.
- Fortynn exosomes i 600 ul PBS ved en rekke forskjellige forhold (for eksempel 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 og 1: 1200).
- Visualisere exosomes av laser lysspredning med riktig instrument og programvare i sanntid ifølge produseresrer protokoll 20.
- Øke nivået av kameraet i opptaksmodus til partiklene blir synlige, deretter justere fokus for å gjøre partiklene ser glatt.
- Mens i standardmodus, redusere kameraet til det laveste nivået at partiklene kan fortsatt bli sett, om nødvendig justere kameralukker og gevinst for å oppnå dette.
- Visuell kontroll for å sikre 20-100 partikler er synlige på skjermen, hvis ikke tømme enheten og juster fortynning i PBS.
- Juster deretter fange varigheten til mellom 30-60 sek. Etter at videoen er fanget, justere prosessparametere inntil alle partiklene er identifisert på skjermen og behandle videofilen.
4. Exosome Karakterisering av Western Blot
- Lyse exosome pellets fra 2-5 ml av galle i 100 ul iskald radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer med en protease inhibitor ved å pipettere opp og ned grundig og blandes lysater kraftig i 30 sekpå en vortex å oppløseliggjøre proteinene effektivt.
- Mens mesteparten av tiden ikke er nødvendig, benytte puls-sonikering av prøvene på is med 2 pulser for hver 10 sek for å sikre fullstendig lysis.
- Pelletere uoppløselig materiale ved sentrifugering ved 15.000 xg ved 4 ° C i 5 minutter og supernatanten overføres til et rent rør.
- Bestem proteinkonsentrasjonen med en fremgangsmåte for valg (dvs. bicinchoninic syre (BCA), Coomassie, modifisert Lowry, 660 nm Protein Assay, etc.) i henhold til produsentens protokoll. Fremgangsmåten er ikke så viktig, så lenge som samme metode brukes konsekvent å oppnå resultater som kan sammenlignes på tvers av eksperimenter.
- Belastning 50 ug protein per prøve i Laemmli-buffer etter oppvarming av prøven ved 95 ° C i 5 minutter inn i en brønn på en polyakrylamidgel for elektroforese (PAGE).
- Electrophorese prøvene på siden gels i 1,5 timer og overføre de utskilte proteiner på en nylonmembran.
- Blåse membranen (e) med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann med 0,1% Tween 20 (TBS-T) i 1 time, deretter inkuberes med exosome-spesifikke antistoffer som anti-CD63 og anti-TSG-101 ved en fortynning av 1: 500 fortrinnsvis O / N ved 4 ° C.
- Vaske membranene med TBS-T 3 x 10 min, deretter inkuberes med en egnet, samsvarende HRP-konjugert sekundært antistoff i 5% fettfri melk i TBS-T i 1-2 timer ved romtemperatur.
- Vask membranen (e) 3 x 5 min med TBS-T og gjenkjenne spesifikke proteiner med Chemiluminescence reagenser i henhold til produsentens protokoll.
- Bilde membraner med film eller en digital bildesystem i henhold til produsentens protokoll.
5. mikroRNA Isolasjon fra den isolerte Exosomes
Merk: Isolering av miRNA fra galle exosomes utføres under anvendelse av en modifisert miRNA isolasjon basert på et kommersielt tilgjengelig kit, men ethvert annet RNA isolasjonsmetoden kan anvendes eller tilpasses.
- Tilsett 300 &# 181; l lyse / bygningen buffer til exosome pellet (isolert fra 400 ul galle), vortex, pipette eller passere gjennom en nål / sprøyte til helt lysere exosomes å få en homogen lysat.
- Legg 1/10 (30 mL) volumet av miRNA Homogenate Additive, og bland godt ved å virvle eller snu røret flere ganger.
- Inkuber blandingen i 10 minutter på is.
- Legge til et volum på syre-fenol: kloroform som tilsvarer den opprinnelige homogenatet (300 ul).
- Tilsett 5 mL av 5 fmol / ul cel-MIR 39 og vortex i 30-60 sek.
- Sentrifuger i 5 minutter ved 10.000 xg ved romtemperatur for å separere den vandige (øvre) og organiske (nedre) fase.
- aspirer forsiktig øvre fase ved pipettering og overføring til et nytt rør mens merke volumet overført. Kast den organiske fase i den passende organisk avfallsbeholder.
- For å anrike for små RNA legge til 1/3 volum på 100% etanol til den gjenvundne vandige fase, og bland ved virvling grundig eller invertering av tuvære flere ganger.
- Pipette lysatet / etanolblanding på filterpatronen, opp til 700 pl av gangen.
- Sentrifuger kassetter for 15 sek på maksimalt 10 000 xg eller bruke vakuum for å passere blandingen gjennom filteret.
- Samle filtratet og hvis lysat / etanolblandingen stiger 700 gl, overføre gjennomstrømning til et nytt rør og gjenta prosedyren for å samle alle filtratene. Disse filter inneholder RNA fraksjoner blottet for små RNA og kan brukes til å gjenopprette disse større RNA.
- Legge til 2/3 volum av RT 100% etanol til den samlede filtrat og bland ved virvling.
- Pipette filtratet / etanolblanding på en annen filterpatron. Som før maksimalt volum som kan brukes på en gang er 700 mikroliter.
- Sentrifuger i 15 sekunder ved 10.000 x g eller anvend vakuum som beskrevet i trinn 5,10.
- Kast gjennomstrømnings, og gjenta inntil alt filtrat / etanolblanding er blitt filtrert.
- Påfør 70081; l miRNA vaskeløsning en til filterpatronen, sentrifuger i 5-10 sek eller anvend vakuum og kast den gjennomstrømning.
- Vask filteret med 500 mL vaskeløsning 2/3 som gjøres i trinn 5.16.
- Gjenta vaske en andre gang med 500 ul vaskeløsning 2/3 som i trinn 5,16, forkaste gjennomstrømnings og plassere filteret tilbake i oppsamlingsrøret.
- Spinn filterpatronen i 1 min ved 10.000 xg for å fjerne alt resterende væske fra filteret.
- Overfør filterpatronen inn i en ny samling rør og anvende 100 ul varm (95 ° C) nuklease fritt vann til sentrum av filteret.
- Spinn samlinger for 20-30 sek ved maksimal hastighet for å gjenvinne RNA.
- Samle eluatet og bruke umiddelbart eller oppbevares ved -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siden exosomes er for liten til å bli detektert ved vanlig mikroskopi eller flowcytometri, har elektronmikroskopi eller optisk analyse nanopartikler som skal utføres. Den nanopartikkel optisk analyse har den fordel i forhold til elektronmikroskopi at det er også kvantitativt og gir størrelsesfordeling og konsentrasjon. Instrumentet innfører en fint fokusert laserstråle gjennom et glassprisme inn i prøven. Den Brownske bevegelser av de isolerte vesikler fanges via en EMCCD høy følsomhet kamera og sporet på en bilde-for-bilde basis. De nanopartikkel sporing analyse (NTA) programvare tiltak dette Brownske bevegelser ramme å ramme til å beregne størrelsen, modus og fordeling av galle exosome forberedelsene. Figur 1 viser resultatet av en typisk NTA analyse av exosome isolert fra en human galle prøve.
Alternativt kan elektronmikroskopi benyttesfor å bekrefte størrelsen på de isolerte partiklene, riktignok uten kvantifisering. Figur 2A viser det typiske resultat av transmisjonselektronmikroskopi for exosome isolert fra human galle.
For ytterligere verifikasjon av exosomal arten av de isolerte partiklene, Western blots sondering for tilstedeværelse av proteiner som Tsg101 eller tetraspanin CD63, vist i figur 2B, må brukes. Exosome-spesifikke proteiner som ikke eksisterer i seg selv, men exosomes er anriket i tetraspanins, særlig CD9, CD63, CD81 og CD82 med CD63 og CD81 referert til som klassiske exosome markører, og proteiner som er involvert i exosome formasjon som TSG101 og Alix 21. Andre proteiner som heat shock protein beslektet 70 (Hsc70) og 73 (Hsc73), samt store histocompatibility kompleks (MHC) klasse II molekyler kan også bli funnet beriket i exosomes med noen som Hsc73 og det perifere membranassosierte beskytti melkefett globule - epidermal vekstfaktor-faktor 8 (Mfge8) er ganske spesifikk for exosomes utskilt fra dendrittiske celler 21.
Figur 3 viser de typiske sanntid forsterknings plott av en rekke miRNA arter hentet fra exosomes menneskelige galle. Siden exosomes, i motsetning til cellene, mangler pålitelige standarder som 18S eller 28S rRNA eller housekeeping gener som GAPDH eller β-actin for normalisering, er spiking med en syntetisk miRNA viktig. De syntetiske miRNA bør være avledet fra en annen art som cel-Mir 39 fra Caenorhabditis elegans å aktivere en å normalisere uttrykket nivåer effektivt.
For reproduserbarhet er det avgjørende at gallen er behandlet så snart som mulig og ikke frosset før behandlingen som disse forholdene føre til nedbrytning av miRNAs stede i galle. På den annen side, når isolert, exoso mes er svært stabile og ganske motstandsdyktig som lagring ved RT i 48 timer eller inntil tre fryse-tine-sykluser gi neglisjerbare effekter på nivået av minst to arter av miRNA, selv om stabiliteten for miRNA av interesse må bestemmes empirisk.
Figur 1. (Nanopartikkel) NTA analyse for å karakterisere human galle exosomes Galle exosomes ble fortynnet i PBS i forholdet 1:. 600. (A) Størrelse fordeling og konsentrering av el-biler isolert fra human galle. Gjennomsnittsstørrelsen ble bestemt til å være omtrent 97 nm for denne prøve (x-akse: exosomes størrelse, y-akse: exosomes konsentrasjonen for hver størrelse). (B) Eksempel snap shot av den samme prøven analysert i A. Størrelsesområdet viser vesikler som spenner 30-110 nm.= "_ Blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Verifisering av exosomal arten av preparatet ved transmisjonselektronmikroskopi og Western blot. (A) Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) av kuleformede strukturer som er tilstede i human galle 70-110 nm i størrelse. Scale bar er 100 nm. (B) Western blot analyse av galle exosomes viser tilstedeværelsen av de typiske exosome markørproteiner TSG101 og CD63. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Real-time PCR av miRNA arter isolert fra galle exosomes. Fast-time PCR av en MIR matrise viser forsterkningen av flere MIR arter hentet fra menneskelige galle exosomes (x-aksen, PCR syklus nummer, y-aksen, relativ intensitet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å utnytte pålitelig exosomes isolert fra galle, er det viktig å anvende konsistent høy kvalitet isoleringsmetoder for å oppnå høy kvalitet på prøvene i retur. Metodikken er definert i denne artikkelen er en veletablert måte å isolere exosomes og miRNA fra menneskelige galle. Det fremhever flere viktige skritt i karakterisering av isolerte exosomes som et minimum skal omfatte elektronmikroskopi eller nanopartikkel optisk analyse og Western blot.
Det mest avgjørende skritt i isolering av exosomes, i hvert fall når det kommer til miRNA stabilitet, er å behandle frisk galle så snart som mulig. Langvarig oppbevaring av hele galle ved RT eller enda en enkelt fryse-tine syklus kan redusere miRNA innhold mens derimot de isolerte exosomes er svært stabile, selv når den lagres ved RT eller som gjennomgår flere fryse-tine sykluser. Så lenge prøvene aktuelle har vært lagret ved -80 ° C, vellykket isolering av exosomes og MIRNA fra galle kan utføres med stor reproduserbarhet å identifisere miRNA signaturer i prøvene. Det anbefales å først starte med frisk galle for å sikre riktig miRNA integritet. Dette er en viktig faktor når du prøver å bygge opp en samling av galleprøver over tid som ville være tilfelle for pasientprøver. Den gjør det mulig å behandle prøvene som er samlet inn over måneder eller år for å bli prosessert og evaluert på samme tid.
Dette forbedrer i stor grad anvendelsen av galle for diagnostiske formål, enten for å se etter miRNA signaturer som bekrefter nærværet av en sykdomstilstand som kreft eller responsen av en sykdom terapeutiske inngrep. Faktisk har resultater fra kliniske prøver blitt brukt til å etablere miRNA signaturer som biomarkører for kolangiokarsinom 19.
Den første sentrifugeringstrinn fjerner intakte celler som er til stede i gallen. I den andre, høyere hastighet sentrifugering celle debris, er apoptotiske legemer og andre større organpelletert. For å sikre at bare partikler mindre enn 200 nm samles opp i ultrasentrifugetrinnet, er filtreringstrinnet med en lav proteinbinding filter viktig. Noen protokoller utelate dette trinnet, men vi tror det er nødvendig. Etter ultrasentrifugering ved 120.000 xg den oppnådde pellet inneholder forholdsvis ren exosomes som enten kan bearbeides umiddelbart eller etter resuspensjon i PBS lagres ved -80 ° C. En begrensning ved denne metode er at den oppnådde pelleten blir bare høyanriket i exosomes men dette er tilfelle for andre berikelse metoder som størrelseseksklusjonskromatografi og polymere utfelling. Videre behandling kan innebære et annet rensetrinn ved sukrosegradient, eller binding til antistoff-belagte magnetiske kuler. Hvis kilden til de exosomes (som for eksempel plasma) inneholder utfellinger som følge av koagulering, kan denne ekstra rensing er nødvendig, da disse partikler kan ofte ha en størrelse på exosomes.Særlig fører den immuno-rensing til en mer exosome markør beriket forberedelser. Ulempen er at dette ytterligere reduserer mengden av exosomes og / eller miRNA til stede, og for de fleste formål ikke rettferdiggjør den tid- og ressurskrevende prosess. Hvis imidlertid Western blot-analyse detekterer tilstedeværelsen av mikrosomfraksjonen forurensning gjennom en endoplasmatiske retikulum protein slik som calnexin, ytterligere rensing, spesielt immuno-isolasjon basert, anbefales. I vår erfaring er dette sjelden tilfelle for galle, hvis man bruker andre kilder til biologiske væsker en immunbaserte rensetrinnet vil bli anbefalt.
Bruken av differensialultrasentrifugering for å isolere og berike exosomes fra galle fluid er en forholdsvis rask og kostnadseffektiv metode. Selv om det krever bruk av en ultrasentrifuge, fortrinnsvis med en sving spannrotor, disse anordninger er ofte funnet i mange institusjoner. Ytterligere rensing via tetthet sentrifugering er possible med det samme utstyret, og rørene er gjenbrukes flere ganger etter rengjøring og sterilisering. Mens polymerbasert utfelling krever kun anvendelse av mikrosentrifugene eller standard sentrifuger for å pelletere bunnfallet ved en hastighet av 10 000 x g eller mindre, er det vanligvis ko-isolater som ikke er vesikulær forurensninger inkludert lipoproteiner. Mens lipoproteiner er generelt ikke til stede i galle, kostnaden for ofte unike og patenterte polymerer gjør isoleringen kostbare i sammenligning. De polymerer som også er noen ganger uforenlig med nedstrøms applikasjoner som masse-spektrometri, men når nedstrøms analyse er kompatibel med polymeren (RNA eller protein isolasjon), er fremgangsmåten enkel, rask og ikke krever spesielt utstyr.
utelukkelse størrelse kromatografi har nedsiden av lange løpetider og kravet til spesialutstyr, men muliggjør nøyaktig separasjon av store og små partikler. Immunoaffinitetskolonnerensing rensing gir høyest renhet, vanny av exosomal vesikler og til og med tillater isolering av spesifikke exosomal fraksjoner slik som epitel avledet, men dette går på bekostning av den totale utbytte. Videre er det begrenset til små prøver volum som krever en første berikelse trinnet hvis et stort volum som skal behandles og de isolerte exosomes kan miste funksjonell aktivitet eller oppviser endrede biologisk funksjon på grunn av de bundne antistoffer.
Det er viktig å vurdere nedstrøms søknaden (e) og tilgjengeligheten av spesialisert utstyr når det gjelder isolering av exosomes. Karakteriseringen av de isolerte / anrikede partikler er viktig uavhengig av isoleringsmetoden som brukes. Ultracentrifugation har så langt vært en "gullstandard" som brukes av mange laboratorier på grunn av sin robuste og rask (og kostnadseffektivt hvis en ultrasentrifuge er tilgjengelig) anrikning av exosomal partikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
References
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
- Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
- Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
- Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
- Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
- Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
- Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).
