Abstract
Exosome forskning under de senaste tre åren har betydligt längre räckvidd mot identifiering och karakterisering av biomarkörer och deras terapeutiska användningar.
Exosomer har nyligen visats innehålla mikroRNA (MIRS). Mirs själva har uppstått som värdefulla biomarkörer för diagnostiska ändamål. Som provtagning på kliniker och sjukhus är ganska varierande, miRNA isolering från hela galla varierar kraftigt. För att uppnå robusta, noggranna och reproducerbara miRNA profiler från insamlade galla prover på ett enkelt sätt krävs utveckling av en hög kvalitetsprotokoll för att isolera och karakterisera exosomes från galla. Metoden kräver flera centrifuge och ett filtreringssteg med en slutlig ultracentrifugering steg för att pelletera isolerade exosomes. Elektronmikroskopi, Western blöts, flödescytometri och flera parametrar nanopartiklar optisk analys, där sådana finns, är avgörande karakteriserings åtgärder för att verifiera kvaliteten på exosomes. För isoleringen av miRNA från dessa exosomer, spiking lysatet med en icke-specifik, syntetisk miRNA från en art som Caenorhabditis elegans, dvs, Cel-miR-39, är viktigt för normalisering av RNA extraktionseffektivitet. Isoleringen av Exosome från galla vätska följer denna metod gör det möjligt för framgångsrika miRNA profilering från galla prov lagrade under flera år vid -80 ° C.
Introduction
Liksom andra biologiska vätskor, dvs bröstmjölk, plasma eller urin, innehåller galla exosomes, fettrika blåsor 1-4. Exosomes kan inducera eller ändra biologiska funktioner i mottagarceller 5, 6, en form av cell-cell kommunikation som kan vara en del av deras normala funktion 4, 7-9. Exosomes kan innehålla miRNA arter som kan ge en värdefull källa av biomarkörer för diagnos 10. miRNA profiler har fått avsevärd uppmärksamhet under senare år som diagnostiska och prognostiska markörer för en mängd olika sjukdomar 11-14.
miRNA själv finns i biologiska vätskor, eventuellt frigörs av döda celler och mängden skjul celler kan i hög grad påverkas av en underliggande sjukdom. Mirna profilen exosomes inte nödvändigtvis återspeglar den miRNA profil cell ursprung 6, 10, 15-17, men exosomes kan bära miRNA signaturer som kan vara kännetecknande för föräldra cell som en tumörcell. Tumörhärrörande exosomer har identifierats i plasma hos patienter med lungadenokarcinom, prostatacancer och andra tumörer 8, 16, 18.
Målet med denna metod är tillförlitlig och robust isolering av exosomes från mänskliga galla exemplar, i stort sett oberoende av deras tidigare hanteringsprocedurer. Den utvecklades för att utnyttja galla som en pålitlig källa för miRNA för den potentiella diagnostik av sjukdomar i gallgången såsom kolangiokarcinom 19. Det består av flera steg av centrifugering med ökande hastigheter för att isolera exosomes och skulle kunna tillämpas på andra biologiska vätskor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Erhålla galla från patienter med endoskopisk retrograd kolangiopankreatografi (ERCP) kräver godkännande av en mänsklig försöksstudieprotokoll av Institutional Review Board. Allt arbete som presenteras här godkändes av Johns Hopkins University Institutional Review Board.
1. Exosome Isolering från Bile
- Utför endoskopisk retrograd kolangiopankreatografi (ERCP). Placera patienten i ryggläge och intuberas.
- Passera en duodenoscope genom patientens mun och sätt in den i den andra delen av tolvfingertarmen och identifiera huvud papilla.
- Selektivt cannulate gallgången genom att sätta en trippel lumen sfinkterotom förinstallerade med en 0,035 tum (0,9 mm) hydrofila ledaren.
- Advance ledaren under fluoroskopisk ledning till vänster leverkanalen eftersom ibland kan det vara svårt att skilja cystisk kanal från höger lever kanalen, sedan förasfinkterotom 5 cm in i gallgången att förvärva en stabil position.
- Ta ledaren, bifoga en 10 ml spruta till ledaröppningen genom Luer lås och aspirera gallan med hjälp av 10 ml undertryck.
- Ta bort sprutan innehållande galla att fortsätta med ERCP genom sätta tillbaka ledaren och injicera kontrastmedel genom injektionsporten att opacify gallan trädet.
- Överför samlas galla i ett 15 ml rör på is och hålla på is tills redo att gå vidare med centrifugeringssteget.
Varning: Använd handskar för att skydda dig själv och proverna! Behandla galla som en potentiell källa till infektion eftersom det kan innehålla hepatit A-viruspartiklar! - Hålla provet (proven) på is. Antingen fortsätta med steg 1,2 eller centrifugera vid 500 xg vid 4 ° C under 10 min och sedan frysa vid -80 ° C tills vidare användning.
Obs: Prover lagras på detta sätt i flera år har rutinmässigt använts med goda resultat 19. - Överför 400 | il av galla in i ett mikrocentrifugrör och samla upp celler och cellrester genom centrifugering vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten genom pipettering, överföring till ett färskt mikrocentrifugrör och centrifugera provet (proven) vid 16.500 xg under ytterligare 20 min vid 4 ° C för att ta bort supernatanten av ytterligare skräp. Kasta rören i biologiskt avfall. Alternativt, snurra proven i en ultracentrifug i stället.
- Samla upp supernatanten och filtrera den i en biosäkerhet skåp med en spruta genom ett 0,2 pm polyetersulfon (PES) membranfilter som har goda flödeshastigheter och låg proteinbindning för att avlägsna eventuella partiklar större än 200 nm kvar.
- Pipettera den filtrerade supernatanten till ultracentrifugrör och tillsätt PBS så att rören är mer än 2/3 full. Om rören innehåller mindre vätska än så kommer rören kollapsar under centrifugeringen! Rören kan tvättas, autoklaveras och återanvändas flera gånger.
- Pellet de exosomes genom ultracentrifugering vid 120.000 xg under 70 min vid 4 ° C. Efter centrifuger titta på botten av ultracentrifugrör att ibland se små gula pelletar; dessa är de exosomes.
- Kassera supernatanten genom att försiktigt dekantering den och desinficera avfallet genom att tillsätta blekmedel till en slutlig koncentration av 10% volym / volym och låt den stå i 20 min.
- För experiment nedströms, antingen bearbeta pellet (s) i en liten volym av den lämpliga lösningen (dvs radioimmunfällning analys (RIPA) buffert för proteinisolering, RNA lyseringsbuffert för miR isolering) eller återsuspendera det i 50 till 150 | j, l av fosfatbuffrad saltlösning (PBS), som kan antingen lagras vid -80 ° C för framtida användning (kvantitativ realtids-polymeraskedjereaktion (QRT-PCR) eller protein extraktion etc.) eller används för karakterisering av Exosome beredning genom TEM eller nanopartikel optisk analys .
2. Exosome Identifiering medTransmissionselektronmikroskopi (TEM) eller CryoEM
- Resuspendera extracellulära vesiklar i 100 pl av PBS genom att pipettera. Helst använder exosomes som inte har lagrats vid -20 ° C eller -80 ° C, i synnerhet när de utför isolering för första gången.
- Adsorbera en 20 ul alikvot (ca 2 mikrogram) till 400 mesh kolbelagda Parlodion koppargaller i 2 minuter och låt torka vid rumstemperatur.
- Fixera Exosome i 1% (volym / volym) glutaraldehyd (EM-grad) under 5 min vid RT genom att placera droppar noggrant på det torkade preparatet.
- Tvätta gallren två gånger med vatten under 5 min och sedan kontrast fläck elbilar med en% fosfowolframsyra (PTA) för 30 sek.
- Förvärva bilder med ett elektronmikroskop med en accelerationsspänning av 80 kilovolt med början vid förstoringar av 20.000x och ökning till 100,000X vid fastställandet av storleken av partiklarna.
Obs: Andra preps som skiktning på Formvar kolbelagda 200 mesh koppar eller nickel nät och kontrast färgning like 1% eller 2% uranylacetat under 10-15 min är också möjliga. - För CryoEM, blanda en 20 pl alikvot (ca 2 mikrogram) med 60 ul Protein G guld 10 nm (1: 3 förhållande). Detta kommer att bidra till att avgöra Exosome diameter.
- Överför proverna till glöd urladdat C-plan holey kol gallren och ta bort överflödig vätska genom blotting. Frysa gallren genom att doppa dem omedelbart i flytande etan.
- Montera gallren i en cryoholder i flytande kväve.
- Förvärva bilder på 200 kV med förstoringar av 20.000 och 100,000X.
3. Exosome Identifiering av flera parametrar nanopartiklar optisk analys
- Resuspendera de isolerade exosomes i 100 pl av PBS genom att pipettera.
- Späd exosomer i 600 ^ il PBS vid flera olika förhållanden (som 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 och 1: 1200).
- Visualisera exosomes genom laserljusspridning med ett lämpligt instrument och mjukvara i realtid enligt fabrikationsfelRER protokoll 20.
- Höja nivån på kameran i fotograferingsläge tills partiklarna blir synliga, sedan justera fokus att göra partiklarna ser jämn ut.
- Även i standardläge, minskar kameran till den lägsta nivån att partiklarna kan fortfarande ses vid behov justera kamerans slutare och förstärkning för att uppnå detta.
- Kontrollera visuellt för att säkerställa 20-100 partiklar syns på skärmen, om inte spola enheten och justera utspädning i PBS.
- Justera sedan fånga varaktighet till mellan 30-60 sek. När videon fångas, justera processparametrarna tills alla partiklar identifieras på skärmen och bearbeta videofilen.
4. Exosome Karaktärisering genom Western Blot
- Lyserar Exosome pellets från 2-5 ml av galla i 100 pl iskall analys med radioimmunoprecipitation (RIPA) buffert med en proteashämmare genom pipettering upp och ned grundligt och blanda lysat kraftigt i 30 sekpå en virvel för att solubilisera proteinerna effektivt.
- Medan större delen av tiden inte är nödvändigt, använda puls sonikering av proverna på is med 2 pulser för 10 sekunder vardera för att säkerställa fullständig lys.
- Pelletera olösligt material genom centrifugering vid 15.000 xg vid 4 ° C under 5 min och överföra supernatanten till ett rent rör.
- Bestämma proteinkoncentrationen med ett förfarande för val (dvs bicinkoninsyra (BCA), Coomassie, modifierad Lowry, 660 nm Protein Assay, etc.) i enlighet med tillverkarens protokoll. Metoden är inte lika viktigt som länge samma metod används konsekvent för att nå resultat som kan jämföras över experiment.
- Belastning 50 | ig protein per prov i Laemmli-buffert efter upphettning av provet vid 95 ° C under 5 min i en brunn i en polyakrylamidgel för elektrofores (PAGE).
- Elektrofores av proverna på PAGE-geler i 1,5 h och överföra de separerade proteinerna till ett nylonmembran.
- Blåsa membranet (er) med 5% fettfri mjölk i Tris-buffrad saltlösning med 0,1% Tween 20 (TBS-T) under 1 timme, sedan inkubera med Exosome specifika antikroppar såsom anti-CD63 och anti-TSG-101 vid en spädning av 1: 500 företrädesvis O / N vid 4 ° C.
- Tvätta membranen med TBS-T 3 x 10 min, sedan inkubera med ett lämpligt, matchande HRP-konjugerad sekundär antikropp i 5% fettfri mjölk i TBS-T under 1-2 timmar vid RT.
- Tvätta membranet (s) 3 x 5 min med TBS-T och detektera de specifika proteiner med kemiluminescens reagens enligt tillverkarens protokoll.
- Image membranen med film eller ett digitalt avbildningssystem enligt tillverkarens protokoll.
5. MicroRNA Isolering från den isolerade exosomes
Anmärkning: Isolering av miRNA från galla exosomer utförs med användning av en modifierad miRNA isolering baserad på en kommersiellt tillgänglig kit, men varje annan RNA-isolering metod kan användas eller anpassas.
- Lägg 300 &# 181; l lys / byggnad buffert till Exosome pellet (isolerad från 400 | j, l galla), virvel, pipett eller passera genom en nål / spruta för att fullständigt lysera exosomes att erhålla en homogen lysatet.
- Lägg 1/10 (30 pl) volym av miRNA Homogenat tillsats, och blanda väl genom skakning eller vända röret flera gånger.
- Inkubera blandningen under 10 min på is.
- Lägg till en volym av syra fenol: kloroform lika med den ursprungliga homogenatet (300 | il).
- Tillsätt 5 pl av 5 fmol / l cel-miR 39 och virvel för 30-60 sekunder.
- Centrifugera i 5 minuter vid 10.000 xg vid RT för att separera den vattenhaltiga (övre) och organiska (lägre) fasen.
- Försiktigt aspirera övre fasen genom pipettering och överföring till ett nytt rör och samtidigt notera volymen överföras. Kasta den organiska fasen i en lämplig avfallsbehållare organiskt.
- För anrikning av små RNA lägga 1/3 volym av 100% etanol till den utvunna vattenfasen och blanda genom att noggrant vortexa eller vända tuvara flera gånger.
- Pipettera lysatet / etanol blandningen på filterkassetten, upp till 700 | j, l i taget.
- Centrifugera patroner för 15 s vid ett maximum av 10.000 xg eller tillämpa vakuum för att passera blandningen genom filtret.
- Samla upp filtratet och om lysatet / etanolblandningen överstiger 700 pl, överföra genomströmning till ett nytt rör och upprepa proceduren att samla alla filtraten. Dessa filter innehåller RNA-fraktionerna som saknar små RNA och kan användas för att återvinna dessa större RNA.
- Lägg 2/3 volym RT 100% etanol till den totala filtratet och blanda väl genom att vortexa.
- Pipet filtratet / etanolblandningen till en andra filterpatron. Liksom tidigare den maximala volymen som kan tillämpas på en gång är 700 l.
- Centrifugera i 15 s vid 10000 xg eller anbringa vakuum såsom beskrivs i steg 5,10.
- Kassera genomströmning, och upprepa tills alla filtrat / etanol-blandning har filtrerats.
- applicera 70081; l miRNA Tvättlösning 1 till filterpatronen, centrifugera i 5-10 sek eller anbringa vakuum och kassera genomströmning.
- Tvätta filtret med 500 pl tvättlösning 2/3 som görs i steg 5,16.
- Upprepa tvätta en andra gång med 500 ul av tvättlösning 2/3 som i steg 5,16, kasta genomströmning och placera tillbaka filtret i provröret.
- Snurra filterpatron för en min vid 10000 xg för att avlägsna all resterande vätska från filtret.
- Överföra filterpatronen i ett färskt uppsamlingsrör och applicera 100 pl av varm (95 ° C) nukleasfritt vatten till centrum av filtret.
- Snurra aggregat för 20-30 sekunder vid maximal hastighet för att återvinna RNA.
- Samla upp eluatet och använd omedelbart eller förvara vid -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eftersom exosomer är för små för att detekteras genom regelbunden mikroskopi eller flödescytometri, har elektronmikroskopi eller nanopartikel optisk analys som skall utföras. Nanopartikel optisk analys har den fördelen framför elektronmikroskopi att det också är kvantitativ och ger storleksfördelning och koncentration. Instrumentet införs en fint fokuserad laserstråle genom ett glasprisma in i provet. Den Brownsk rörelse av de isolerade blåsor fångas via en EMCCD hög känslighet kamera och spåras på en ram-för-ram-basis. De nanopartikelspårningsanalys (NTA) programvaruåtgärder detta Brownsk rörelse ram till ram för att beräkna storleken, läget och fördelningen av galla Exosome preparat. Figur 1 visar resultatet av en typisk NTA analys av Exosome isolerades från ett humant galla prov.
Alternativt kan elektronmikroskopi utnyttjasatt bekräfta storleken på de isolerade partiklarna, om än utan kvantifiering. Figur 2A visar det typiska resultatet av transmissionselektronmikroskopi för Exosome isolerades från human galla.
För ytterligare verifiering av exosomal typ av isolerade partiklar, Western blöts sondering med avseende på förekomst av proteiner som Tsg101 eller tetraspanin CD63, som visas i figur 2B, måste användas. Exosome specifika proteiner existerar inte i sig, utan exosomer är anrikade i tetraspanins, speciellt CD9, CD63, CD81 och CD82 med CD63 och CD81 kallade klassiska Exosome markörer och proteiner involverade i Exosome bildning som TSG101 och Alix 21. Andra proteiner som värmechockproteinet cognate 70 (hsc70) och 73 (Hsc73), såväl som större histokompatibilitetskomplex (MHC) klass Il-molekyler kan också hittas anrikad på exosomes med vissa som Hsc73 och det perifera membranassocierat protei mjölkfett kula - epidermal tillväxtfaktor faktor 8 (Mfge8) är ganska specifik för exosomes utsöndras från dendritiska celler 21.
Figur 3 visar de typiska realtidsförstärknings plottar av en variation av miRNA arter extraherade från exosomes av human galla. Sedan exosomes, till skillnad från celler, saknar tillförlitliga standarder som 18S eller 28S rRNA eller housekeeping-gener som GAPDH eller β-aktin för normalisering, är det viktigt att spiking med en syntetisk miRNA. De syntetiska miRNA bör härledas från en annan art som cel-miR 39 från Caenorhabditis elegans att göra det möjligt att normalisera expressionsnivåer på ett effektivt sätt.
För reproducerbarheten är det kritiskt att gallan bearbetas så snart som möjligt och får inte frysas före bearbetning eftersom dessa förhållanden leder till nedbrytning av miRNA närvarande i gallan. Å andra sidan, en gång isolerats, exoso mes är mycket stabil och ganska resistenta lagring vid rumstemperatur under 48 timmar eller upp till tre frys-tö cykler orsakar försumbara effekter på nivåerna av minst två arter av miRNA, även om stabilitet för miRNA av intresse måste bestämmas empiriskt.
Figur 1. (Nanoparticle) NTA-analys för att karakterisera mänskliga biliary exosomer Bile exosomer späddes i PBS i förhållandet 1:. 600. (A) Storleksfördelning och koncentration av elbilar isolerade från human galla. Den genomsnittliga storleken bestämdes till cirka 97 nm för detta prov (x-axeln: exosomes storlek, y-axel: exosomes koncentration för varje storlek). (B) Exempel snapshot av samma prov analyseras i A. storleksintervallet visar blåsor som sträcker sig från 30 till 110 nm.= "_ Blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kontroll av exosomal preparatets art av Transmissionselektronmikroskopi och Western blot. (A) Transmissionselektronmikroskopi (TEM) av sfäriska strukturer som finns i människans galla 70-110 nm i storlek. Skala bar är 100 nm. (B) Western blot-analys av galla exosomes visar närvaron av de typiska Exosome markörproteiner TSG101 och CD63. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Realtids-PCR av miRNA arter isolerade från galla exosomes. Real-tid PCR av en miR array visar förstärkningen av flera Mir arter som utvunnits ur mänskliga galla exosomes (x-axeln, PCR-cykel nummer, y-axeln, relativ intensitet). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att på ett tillförlitligt sätt utnyttja exosomer isolerade från galla, är det viktigt att använda en jämn och hög kvalitet isolering metoder för att få hög kvalitet prover i gengäld. Den metod som anges i detta dokument är ett väletablerat sätt att isolera exosomes och miRNA från human galla. Det belyser flera viktiga steg i karakteriseringen av de isolerade exosomes som åtminstone bör innehålla elektronmikroskopi eller nanopartiklar optisk analys och Western blöts.
Den mest avgörande steget i isolering av exosomes, åtminstone när det gäller miRNA stabilitet, är att behandla färsk galla så snart som möjligt. Långvarig lagring av hela galla vid RT eller ens en enda frys-tö cykel kan avsevärt minska miRNA innehåll medan däremot de isolerade exosomes är mycket stabil även vid förvaring vid rumstemperatur eller genomgår flera frys-tö cykler. Så länge som proverna i fråga har förvarats vid -80 ° C, framgångsrik isolering av exosomes och miRNA från gallan kan utföras med stor reproducerbarhet för att identifiera miRNA signaturer i proverna. Det rekommenderas att först börja med färsk galla för att säkerställa korrekt miRNA integritet. Detta är en viktig faktor när man försöker bygga upp en samling av galla prover över tiden såsom skulle vara fallet för patientprover. Det gör det möjligt att bearbeta prover som har samlats in under månader eller år som skall bearbetas och utvärderas samtidigt.
Detta ökar i hög grad användningen av galla för diagnostiska ändamål, antingen för att leta efter miRNA signaturer som bekräftar förekomsten av ett sjukdomstillstånd som cancer eller svaret av en sjukdom terapeutiska ingrepp. I själva verket har resultat från kliniska prover använts för att fastställa miRNA signaturer som biomarkörer för kolangiokarcinom 19.
Det första centrifugeringssteg avlägsnar intakta celler som är närvarande i gallan. I det andra, centrifugering med högre hastighet cell debris, är apoptotiska kroppar och andra större organpellete. Att säkerställa att endast partiklar som är mindre än 200 nm uppsamlas i ultracentrifugesteget är viktigt filtreringssteget med ett lågproteinbindande filter. Vissa protokoll hoppa över detta steg, men vi anser att det är nödvändigt. Efter ultracentrifugering vid 120.000 xg pelleten som erhålls innehåller ganska rena exosomes som antingen kan bearbetas omedelbart eller efter resuspension i PBS förvaras vid -80 ° C. En begränsning med denna metod är att den erhållna pelleten endast är starkt anrikad på exosomes men detta är sant för andra metoder anriknings såsom storleksuteslutningskromatografi och polymer-fällning. Ytterligare bearbetning kan medföra ytterligare reningssteg genom sukrosgradient eller bindning till antikroppsbelagda magnetiska pärlor. Om källan av exosomes (som till exempel plasma) innehåller utfällningar som ett resultat av koagulering, kan denna extra rening vara nödvändig eftersom dessa partiklar ofta kan ha storleken på exosomes.I synnerhet leder immun rening till en mer Exosome markör berikat preparat. Nackdelen är att detta minskar ytterligare mängden av exosomes och / eller miRNA närvarande, och för de flesta ändamål inte motivera den tid och resurskrävande process. Om emellertid detekterar Western blot-analys närvaron av kontamine mikrosom genom ett endoplasmatiskt retikulum-protein såsom kalnexin, ytterligare rening, i synnerhet immuno-isolering baserad, rekommenderas. Enligt vår erfarenhet är detta sällan fallet för galla, om man använder andra källor för biologiska vätskor ett immunbaserat reningssteget skulle rekommenderas.
Användningen av differentiell ultracentrifugering för att isolera och anrika exosomer från galla fluiden är en relativt snabb och kostnadseffektiv metod. Även om det kräver användning av en ultracentrifug, företrädesvis med en gunga hink rotor, dessa enheter är vanligt förekommande i många institutioner. Ytterligare rening via densitetscentrifugering är possible med samma utrustning och rören är återanvändbara flera gånger i följd rengöring och sterilisering. Medan polymerbaserad utfällning kräver endast användning av microcentrifuges eller standard centrifuger för att pelle fällningarna vid en hastighet av 10.000 xg eller mindre, i allmänhet sam-isolerar det icke-vesikulära föroreningar inklusive lipoproteiner. Medan lipoproteiner är i allmänhet inte närvarande i gallan, kostnaden för de ofta egna och patenterade polymerer gör isoleringen dyra i jämförelse. Polymererna är också ibland är oförenliga med tillämpningar nedströms, såsom masspektrometri, men när nedströmsanalys är kompatibel med polymeren (RNA eller proteinisolering), är metoden enkel, snabb och inte kräver särskild utrustning.
Storleksuteslutande kromatografi har den nackdelen av långa gångtider och kravet på speciell utrustning, men tillåter den exakta separation av stora och små partiklar. Immunoaffinitetsrening ger den högsta purity av exosomal vesiklar och även gör det möjligt för isolering av specifika exosomal fraktioner såsom epitel härledd, men detta sker på bekostnad av den totala utbyte. Dessutom är den begränsad till små prov volymer som kräver ett första anrikningssteg om en stor volym skall bearbetas och de isolerade exosomes kan förlora funktionell aktivitet eller uppvisar förändrad biologisk funktion på grund av att de bundna antikropparna.
Det är viktigt att tänka på nedströms ansökan (s) och tillgång till specialutrustning när det gäller isolering av exosomes. Karakterisering av de isolerade / berikade partiklar är viktig oavsett isoleringsmetod som används. Ultracentrifugering har hittills varit en "gold standard" som används av många laboratorier på grund av sin robusta och snabba (och kostnadseffektivt om en ultracentrifug finns) anrikning av exosomal partiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
References
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
- Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
- Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
- Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
- Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
- Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
- Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).
