Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.
Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating “experimental” metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.
Metastas är en viktig orsak till dödsfall hos patienter med maligniteter. Processen av metastaserad spridning av cancerceller är dåligt förstådd men tycks involvera flera steg, inklusive invasionen av angränsande vävnader, intravasering i lymfkärlen och kärl, överlevnad och translokation inom cirkulationssystemet, extravasering från kärlsystemet på platsen för metastaser, anpassning till den nya mikro av den nya webbplatsen, och kolonisering på den nya platsen genom proliferation och bildning av sekundära tumörer. 1 Var och en av dessa biologiska händelser innebär omvandling, spridning och överlevnad av metastaserande tumörceller. Till exempel, omvandlingen av den epiteliala fenotypen av tumörcellen in i en mesenkymal fenotyp, tillsammans med det framgångsrika interaktionen med den extracellulära matrisen, det möjligt för dem att invadera intilliggande vävnader och metastasera till andra delar av kroppen. 2,3 Vidare dessa metastatisk cellermåste överleva i det cirkulerande blodet och undvika immunkontroll från värden. 4,5 slutligen när de implanteras i en avlägsen plats i kroppen, måste tumörcellerna anpassar sig till sin mikro för att föröka sig och bilda sekundära tumörer. 6,7 Därför , även metastaser är ett vanligt fenomen bland cancerpatienter, metastaserande tumörceller har flera områden av sårbarhet som är mottagliga för terapeutisk intervention.
Med tanke på den immunogena karaktär melanom, och den senaste tidens intresse för immunterapier, modeller för melanom är allt bra. 8 I USA ensam, är melanom orsaken till uppskattningsvis 9.000 dödsfall per år. 9 Vanliga platser för melanom metastas är ben, hjärna , lever och lungor. Majoriteten av metastaser till avlägsna platser uppstår genom blodomloppet. Cirkulerande tumörceller i blodet måste undvika immun clearance, nå en kapillär bädd av en distal organ ochinvadera genom endotelcellerna i blodkärlet för att framgångsrikt etablera sig. 4-7,10, 11
Att efterlikna de gemensamma och virulent fenomen metastas, var murina B16-BL6 cellinje skapas. En avlidnes föräldra C57BL / 6 melanomcellinje B16-F0, är B16-BL6 slutprodukten av 10 på varandra följande val för lungmetastaser från intravenös injektion (vilket resulterar i B16-F10), följt av 6 på varandra följande val för blåsmembranpenetration. 12 Som sådan, är det en pålitlig melanom cellinje för etablering av metastatiska härdar i musen, i synnerhet när det injiceras intravenöst. 13
Efter injektion av en tillräcklig mängd av B16-BL6-celler i svansvenen av en B57BL / 6 mus, följt av två eller flera veckor för att tillåta implantation och tillväxt av B16 / BL6-celler, kommer metastatiska härdar bildas i lungorna. Vid eutanasi och inspektion av dissekera mikroskop, antaletindividuell foci närvarande kan kvantifieras. Detta, i sin tur, kan användas för att etablera en dos-metastas effekt, eftersom antalet injicerade B16-BL6-celler korrelerar med antalet foci bildas på ytan av lungorna. Denna modell är känd som "experimentell metastas", där kända-metastaserande celler införs direkt in i blodomloppet, vilket underlättar en snabb och förutsägbar spridning och etablering i lungorna, levern eller andra organ för utredning. Detta står i kontrast till "spontan metastas", där tumörceller implanteras ofta subkutant och metastaser härröra från organiskt kasta cancerceller. 14,15
Det är viktigt att injicera en lämplig mängd B16 / BL6-celler in i svansvenerna hos mössen. Alltför många och lungorna kommer att täckas med metastaser och angränsande fokus kommer att vara omöjlig att skilja från varandra. Alltför få, och påverkan av ett terapeutiskt medel kommer att urskiljas på grund av inneboende Variheten mellan injektioner. För att erhålla ett optimalt antal foci på lungorna hos C57BL / 6-möss, är det nödvändigt att korrelera antalet injicerade celler med den mängd etablerade metastatiska härdar på ytan av lungorna samtidigt som hänsyn tas till distinguishability för individuellt foci. Detta protokoll kommer att visa en metastatisk murin melanom modell för C57BL / 6-möss.
Cirkulerande tumörceller från en svansveninjektion representerar metastaser som kringgå områden av primär tillväxt och vandrar genom vägar som blodet eller lymfsystemet, ibland etablera sig i kapillära bäddar i avlägsna platser. 14 Protokollet som beskrivs ovan fungerar som en modell för sekundär metastaser. Med ett optimalt antal B16-BL6-celler injicerades, kan praktiker bestämma den relativa effekten av ett administrerat läkemedel eller immuncellpopulation, post-neutralisering, på cancercellmetastaser.
Detta protokoll har begränsningar. De cirkulerande tumörceller har valts ut för sin förmåga att metastasera och är därför icke-immunogen, med lägre nivåer av större histokompatibilitetskomplex klass 1-molekyler. 12 Vidare är den plötsliga och klustrade införandet av stort antal metastaser till skillnad från den typiska scenario i patienter där ett litet antal metastatiska tumörcellerskingra under en längre tid från den primära tumören plats. Dessutom är intravenöst införda tumörcellerna är från vävnadskultur och inte av en primär tumör ursprung. Därför är dessa celler är till skillnad från de sekundära metastaser som är resultatet av förändringar i cellvidfästning, migration, immunigenkänning och mottagare organ etablering. 15,16
Ett alternativt protokoll skulle vara subkutan injektion av B16 / BL6 för generering av primära tumörer och analysen av de resulterande "spontana" lungmetastaser. Dessa "spontana" metastaser har visat sig innehålla mer heterogenitet än deras "experimentella" motsvarigheter, närmare matchar de humanpatienter. Protokollet är begränsande i dess förmåga att bestämma inverkan av en experimentell förening på metastas. Med en lateral injektion svansvenen, kan antalet melanomceller injicerade i blodomloppet approximeras via hemocytometer. Med "spontan" metastas, men det är större heterogenitet mellan tumörer, lägga till ytterligare en variabel till antalet erhållna lung härdar. 16
Sammanfattningsvis representerar svansvenen B16-BL6 murint melanom modell en enkel modell för bestämning av inverkan av en behandling eller immunterapi på metastaser. Genom att intravenöst injicera cirkulerande tumörceller, kan forskare replikera, i viss utsträckning, patienter efter metastas. Med tanke på de destruktiva effekterna av metastaserande tumörceller i cancerpatienter, är denna modell ett kraftfullt verktyg för att förstå flerstegsprocess av metastaser.
The authors have nothing to disclose.
Stöds delvis av en National Cancer Institute bidrag 1R03CA172923.
Trypsin | Corning | MT25052CV | |
RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |