Myofilament सीए का आकलन<sup> 2 +</sup> संवेदनशीलता अंतर्निहित कार्डिएक उत्तेजना संकुचन युग्मन
Summary
This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.
Abstract
दिल की विफलता और कार्डियक arrhythmias मृत्यु दर और रुग्णता दुनिया भर के प्रमुख कारण हैं। हालांकि, रोगजनन और रोगग्रस्त दिल में दौरे की खराबी की व्यवस्था पूरी तरह से स्पष्ट किया जाना बना रहता है। हाल सम्मोहक सबूत यह दर्शाता है कि myofilament सीए 2 संवेदनशीलता में परिवर्तन हृदय myocytes में intracellular सीए 2 homeostasis और आयन चैनल गतिविधियों को प्रभावित, हृदय संभावित कार्रवाई और स्वस्थ और रोगग्रस्त दिलों में संकुचन के लिए जिम्मेदार आवश्यक तंत्र। दरअसल, आयन चैनल की गतिविधियों और ट्रांसपोर्टरों अंतर्निहित हृदय कार्रवाई की क्षमता (जैसे, ना +, सीए 2 और कश्मीर + चैनलों और ना + 2 + -Ca एक्सचेंजर) और intracellular सीए 2 से निपटने प्रोटीन (जैसे।, Ryanodine रिसेप्टर्स और सीए sarcoplasmic जालिका (SERCA2a) या phospholamban और उसके फोस्फोराइलेशन) में 2 + -ATPase पारंपरिक evalu करने के लिए मापा जाता हैहृदय की उत्तेजना-संकुचन (ईसी) युग्मन के मौलिक तंत्र खा लिया। झिल्ली और intracellular सीए 2 परिवर्तन में दोनों विद्युत गतिविधियों, चुनाव आयोग युग्मन के ट्रिगर संकेत हैं जबकि myofilament संकुचन और कार्यात्मक इकाई है, और myofilament सीए 2 संवेदनशीलता myofibril प्रदर्शन के कार्यान्वयन में जरूरी है। फिर भी, कुछ अध्ययनों मायोकार्डियम के कार्यात्मक विश्लेषण में myofilament सीए 2 संवेदनशीलता को शामिल जब तक यह अध्ययन का ध्यान केंद्रित है। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि उपायों sarcomere छोटा / फिर से लंबी और intracellular सीए 2 स्तर Fura-2 AM (ratiometric का पता लगाने) और चूहे दिल से हृदय myocytes में myofilament सीए 2 संवेदनशीलता के परिवर्तन का मूल्यांकन का उपयोग कर का वर्णन है। मुख्य उद्देश्य यह है कि myofilament सीए 2 संवेदनशीलता यंत्रवत विश्लेषण के लिए चुनाव आयोग युग्मन में ध्यान में रखा जाना चाहिए पर जोर देना है। मैं की व्यापक जांचचैनल, आयन ट्रांसपोर्टरों, intracellular सीए 2 + हैंडलिंग, और myofilament सीए 2 संवेदनशीलता है कि स्वस्थ और रोगग्रस्त दिलों में myocyte सिकुड़ना आबाद translational और चिकित्सकीय मूल्य के अधिक प्रभावी रणनीति तैयार करने के लिए बहुमूल्य जानकारी प्रदान करेंगे।
Introduction
कार्डिएक उत्तेजना-संकुचन (ईसी) युग्मन मायोकार्डियम, यानी, दिल 1,2 के सिकुड़ा समारोह के यांत्रिक गुणों का विश्लेषण करने के लिए मौलिक योजना है। चुनाव आयोग युग्मन झिल्ली विध्रुवण sarcolemmal आयन चैनल की गतिविधियों के लिए माध्यमिक द्वारा शुरू की है (जैसे, वोल्टेज gated ना + चैनल, पैच दबाना तकनीक के माध्यम से मापा जा सकता है)। वोल्टेज gated एल प्रकार के बाद सक्रियण सीए 2 चैनल (LTCCs) और सीए LTCCs के माध्यम से 2 + तांता सीए के थोक ट्रिगर 2 + ryanodine रिसेप्टर्स (RyRs) के माध्यम से जारी है, nanomolar से साइटोसोलिक सीए 2 एकाग्रता में वृद्धि (एनएम ) micromolar करने के लिए (माइक्रोन) के स्तर पर। साइटोसोलिक सीए 2 में ऐसी वृद्धि actin-मायोसिन बातचीत की सुविधा को बढ़ावा देता है सीए 2 ट्रोपोनिन सी (टीएनसी) पतली तंतु में करने के लिए बाध्य है और elicits रेशा परिसर के गठनात्मक परिवर्तन और myocardi उपलब्ध हो जाता हैअल 3 संकुचन। इसके विपरीत, साइटोसोलिक सीए 2 वापस एसआर में sarcoplasmic जालिका (एसआर) सीए 2 -ATPase के माध्यम से (SERCA2a) में फिर से uptaken है या ना + / सीए 2 एक्सचेंजर और plasmalemmal के माध्यम से myocyte से बाहर चली जाती है सीए 2 ATPase 1,2। नतीजतन, साइटोसोलिक सीए में गिरावट 2+ पतली तंतु के गठनात्मक परिवर्तन वापस मूल राज्य के लिए, उकसाती actin-मायोसिन और myocyte छूट 1-3 की हदबंदी में जिसके परिणामस्वरूप। सबसे स्तनधारी हृदय कोशिकाओं 1 में साइटोसोलिक सीए 2 हटाने के 90% – इस योजना में, SERCA2a की गतिविधि को आम तौर पर, क्योंकि यह 70 के लिए खातों दौरे छूट की गति का निर्धारण करने के लिए माना जाता है। इस तरह, असामान्य सीए 2 से निपटने LTCC, RYR और SERCA2a आदि के आधार पर बिगड़ा सिकुड़ना और रोगग्रस्त दिल 1-4 में छूट के लिए प्राथमिक तंत्र माना गया है।
<p class="jove_content"> हकीकत में, मुक्त साइटोसोलिक सीए 2 है कि कुल intracellular सीए के 2 + 1% के आसपास के लिए चुनाव आयोग युग्मन खातों में दूत और सीए 2 के बहुमत के रूप में कार्य intracellular सीए 2 + बफ़र्स 5,6 करने के लिए बाध्य है। यह सच है कि विभिन्न सीए 2 buffers, हृदय myocytes में प्रचुर मात्रा में हैं जैसे, झिल्ली फॉस्फोलिपिड, एटीपी, phosphocreatine, calmodulin, parvalbumin, myofibril TNC, मायोसिन, SERCA2a, और एसआर में calsequestrin के कारण है। 5,6,7। उनमें से, SERCA2a और TnC प्रमुख सीए 2 बफ़र्स 5,6,7 हैं। इसके अलावा, सीए 2 अपनी बफ़र्स के लिए बाध्य चिकोटी के दौरान एक गतिशील प्रक्रिया है (जैसे, सीए के 2 + 30-50% TnC को बांधता है और 2 + यात्रियों 7 सीए के दौरान यह से अलग कर देना) और सीए में परिवर्तन 2+ बाध्यकारी कारण अतिरिक्त cytosol करने के लिए स्वतंत्र सीए 2 की "रिलीज", परिणाम intracellular सीए के परिवर्तन में 2 + सान्द्रentration। नतीजतन, intracellular सीए 2 स्तर की गड़बड़ी असामान्य myofilament आंदोलनों, जो सिकुड़ा रोग और arrhythmias 8,9 के पूर्ववर्ती हैं लाती है। कई कारकों (दोनों शारीरिक और रोग) myofilament प्रोटीन के बाद ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों, जो प्रभावित करते myofilament सीए 2 बफरिंग और myofilament सीए 2 संवेदनशीलता 8-10 का स्रोत हो सकता है। हाल ही में, यह बताया गया कि myofilament प्रोटीन में उत्परिवर्तन सीए 2 बंधन आत्मीयता और intracellular सीए 2 से निपटने में वृद्धि, सीए 2 + यात्रियों, असामान्य सीए 2 रिलीज, और arrhythmias 8 के ठहराव पर निर्भर potentiation ट्रिगर। इस अवधारणा के साथ लाइन में, हम भी उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहे दिल न्यूरोनल नाइट्रिक ऑक्साइड synthase की अप-नियमन के लिए माध्यमिक में है कि myofilament सीए 2 desensitization से पता चला है ऊंचा डायस्टोलिक और सिस्टोलिक सीए 2 के स्तर के साथ जुड़ा हुआ है11, जो बारी में, सीए 2 निर्भर निष्क्रियता से 12 LTCC के जोखिम बढ़ जाती है। इसलिए, myofilament सीए 2 संवेदनशीलता एक "सक्रिय" intracellular सीए 2 + homeostasis और myocyte सिकुड़ा समारोह का नियामक है। यह myofilament और सीए के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हो गया है 2+ myocyte चुनाव आयोग युग्मन और हृदय समारोह की पूरी तरह से जांच के लिए प्रोटीन से निपटने।यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि पृथक हृदय myocytes में myofilament सीए 2 संवेदनशीलता के परिवर्तन का आकलन का वर्णन है। Intracellular सीए 2 + प्रोफ़ाइल के व्यापक विश्लेषण, myofilament सीए 2 संवेदनशीलता और संकुचन उपन्यास अंतर्निहित तंत्र दौरे यांत्रिकी पता लगाना होगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एक अलग हृदय myocyte में myofilament सीए 2 संवेदनशीलता के परिवर्तन का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है और electrophysiological गुण के साथ इस पैरामीटर, intracellular सीए 2 + यात्रियों, और myofilament गतिशीलता को मापने के महत्व ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) शिक्षा, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (2013068067) द्वारा वित्त पोषित के माध्यम से बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था; शिक्षा, विज्ञान और प्रौद्योगिकी, सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी अस्पताल, उच्च रक्तचाप के कोरियाई सोसायटी (2013), एस के दूरसंचार रिसर्च फंड के कोरियाई मंत्रालय के ब्रेन कोरिया 21 स्नातकोत्तर कार्यक्रम द्वारा (कोई। 3420130290) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन से (NSFC 31460265; NSFC 81260035)।
Materials
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
References
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