Bedömning av Myofilament Ca²⁺ Känslighet underliggande hjärt Excitation-kontraktion koppling

Summary

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

Hjärtsvikt och hjärtarytmier är de främsta orsakerna till dödlighet och sjuklighet i världen. Dock kvarstår mekanismen för patogenes och hjärtinfarkt fel i sjuka hjärta till fullo klar. Senaste övertygande bevis för att förändringar i myofilament Ca2 ⁺ känslighet påverkar intracellulär Ca2 ⁺ homeostas och jonkanal aktiviteter i hjärtmyocyter, de grundläggande mekanismer som ansvarar för hjärtaktionspotentialen och kontraktion hos friska och sjuka hjärtan. Faktum är att verksamheten i jonkanaler och transportörer underliggande hjärtaktionspotentialer (t.ex. Na ^+, Ca2 ⁺ och K ⁺ -kanaler och Na ⁺ -Ca ²⁺ växlar) och intracellulära Ca2 ⁺ hanterings proteiner (t ex., Ryanodinreceptorer och Ca ²⁺ -ATPas i sarkoplasmatiska retiklet (SERCA2a) eller fosfolamban och dess fosforylering) konventionellt mätas för att utvärdeåt de grundläggande mekanismerna av hjärt excitation-kontraktion (EG) koppling. Båda elektriska aktiviteter i membranet och intracellulära Ca2 ⁺ förändringar är utlösarsignaler i EG koppling, medan myofilament är den funktionella enheten av sammandragning och avslappning, och myofilament Ca2 ⁺ känsligheten är absolut nödvändigt för att genomföra myofibrill prestanda. Ändå är det få studier införliva myofilament Ca2 ⁺ känslighet till den funktionella analysen av hjärtmuskeln om det inte är i fokus för studien. Här beskriver vi ett protokoll som mäter sarcomere förkortning / re-förlängning och den intracellulära Ca2 ⁺ nivå med Fura-2 AM (ratiometrisk detektering) och utvärdera förändringarna i myofilament Ca2 ⁺ känslighet i hjärtmuskelceller från råtthjärtan. Huvudsyftet är att understryka att myofilament Ca2 ⁺ känsligheten bör beaktas i EG koppling för mekanistiska analys. Omfattande undersökning av ipå kanaler, jon transportörer, intracellulär Ca2 ⁺ hantering och myofilament Ca2 ⁺ känslighet som ligger bakom myocyt kontraktilitet hos friska och sjuka hjärtan kommer att ge värdefull information för att utforma mer effektiva strategier för translationell och terapeutiskt värde.

Introduction

Cardiac excitation-kontraktion (EG) koppling är den grundläggande systemet för analys av mekaniska egenskaper hos myokardiet, dvs., den kontraktila funktionen av hjärtat ^1,2. EG koppling initieras genom membrandepolarisering sekundärt till verksamhet sarcolemmal jonkanaler (t.ex. den ^{spänningsstyrda} natriumkanalen, som kan mätas via patch-clamp teknik). Efterföljande aktivering av spänningskänsliga L-typ Ca2 ⁺ kanaler (LTCCs) och Ca ²⁺ inflöde via LTCCs utlösa huvuddelen av Ca2 ⁺ frisättning genom ryanodinreceptorer (RyRs), vilket ökar den cytosoliska Ca2 ⁺ -koncentration från nanomolar (nM ) mikromolar (^ M) nivå. En sådan ökning av cytosoliskt Ca2 ⁺ främjar Ca2 ⁺ bindning till troponin C (TNC) i tunna filament och framkallar konformationsförändringar på glöd komplexet för att underlätta aktin-myosin interaktion och uppnår myocardial kontraktion ^3. Omvänt cytosoliska Ca ^{2 +} åter uptaken tillbaka in i sarkoplasmatiska retiklet (SR) via Ca2 ⁺ ATPas i SR (SERCA2a) eller pressas ut ur myocyt via Na ⁺ / Ca2 ⁺ värmeväxlare och plasmalemmal Ca2 ⁺ ATPas ^1,2. Följaktligen nedgången i cytosoliskt Ca2 ⁺ anstiftar konformationsförändringar av tunna trådar tillbaka till det ursprungliga tillståndet, vilket resulterar i dissociation av aktin-myosin och myocyt avkoppling ^1-3. I detta system är aktiviteten hos SERCA2a allmänt anses bestämma hastigheten av myocardial avkoppling eftersom den står för 70-90% av cytosoliskt Ca2 ⁺ borttagning i de flesta däggdjurshjärtceller ^1. Som sådan onormal Ca2 ⁺ hantering av LTCC, Ryr och SERCA2a, etc. har ansetts de primära mekanismerna för nedsatt kontraktilitet och avkoppling i det sjuka hjärtat ^1-4.

<p class="jove_content"> I verkligheten fri cytosoliskt Ca2 ⁺ som fungerar som budbärare i EG-kopplings står för cirka 1% av den totala intracellulära Ca2 ⁺ och majoriteten av Ca2 ⁺ är bunden till intracellulära Ca ^{2 +} buffertar ^5,6. Detta beror på det faktum att olika Ca2 ⁺ buffertar finns rikligt i hjärtmyocyter, t.ex., membranfosfolipider, ATP, phosphocreatine, kalmodulin, parvalbumin, myofibrill TNC, myosin, SERCA2a och calsequestrin i SR. ^5,6,7. Bland dem, SERCA2a och TNC är de dominerande Ca2 ⁺ buffertar ^5,6,7. Dessutom ²⁺ bindning till dess buffertar är Ca en dynamisk process under rycka (t.ex. binder 30-50% av Ca2 ⁺ till TNC och separera från det under Ca2 ⁺ transienter ⁷⁾ och förändringen i Ca2 ⁺ bindning orsakar ytterligare "släppa" av fri Ca2 ⁺ till cytosolen, resulterar i förändringar av den intracellulära Ca2 ⁺ koncentration. Följaktligen störning av den intracellulära Ca2 ⁺ nivå framkallar onormala myofilament rörelser, som är föregångare till kontraktil dysfunktion och arytmier ^8,9. Många faktorer (både fysiologiska och patologiska) kan vara källor till posttranskription modifieringar av myofilament proteiner som påverkar myofilament Ca2 ⁺ buffring och myofilament Ca2 ⁺ känslighet ^8-10. Nyligen rapporterades det att mutationer i myofilament proteiner ökar Ca2 ⁺ bindningsaffiniteten och intracellulär Ca2 ⁺ hantering, utlöser paus beroende förstärkning av Ca2 ⁺ transienter, onormal Ca2 ⁺ frisättning, och arytmier ^8. I linje med detta koncept, har vi också visat att myofilament Ca2 ⁺ hyposensibilisering hos hypertensiva råtthjärtan sekundära till uppreglering av neuronal kväveoxidsyntas är förknippad med förhöjda diastoliskt och systoliskt Ca2 ⁺ nivåer^11, vilket i sin tur ökar sårbarheten i LTCC till Ca2 ⁺ -beroende inaktive ^12. Följaktligen är myofilament Ca ^{2 +} känslighet en "aktiv" regulator av intracellulär Ca2 ⁺ homeostas och myocyt kontraktil funktion. Det har blivit nödvändigt att analysera interaktioner mellan myofilament och Ca2 ⁺ hanterings proteiner för grundlig utredning av myocyt EG koppling och hjärtfunktion.

Här beskriver vi ett protokoll som bedömer förändringarna i myofilament Ca2 ⁺ känsligheten i isolerade hjärtmyocyter. Omfattande analys av intracellulär Ca2 ⁺ profil kommer myofilament Ca2 ⁺ känslighet och kontraktion gräva nya mekanismer underliggande hjärt mekanik.

Protocol

Protokollet är i enlighet med handledningen för vård och användning av försöksdjur som publicerats av FN: s National Institutes of Health (NIH publikation nr 85-23, reviderad 1996). Den godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) i Seoul National University (IACUC godkännande nr .: SNU-101.213 till 1). 1. Buffer Förberedelse (tabell Material och utrustning) Förbereda 300 ml färskt isolering lösning på dagen för experimentet (i mM: NaCl, …

Representative Results

LV myocyter isoleras från normala och hypertensiva råtthjärtan. Stavformade myocyter med tydliga strimmor (representerande sarkomerer) och stabila kontraktioner som svar på fältstimulering anses vara de optimala myocyter och väljs för inspelningar (Figur 2A). I den i F igure 2A exempel -loaded en Fura 02:00 LV myocyt placeras horisontellt och öppningen av kameran justeras så att myocyt upptar större delen av inspelningen fältet och minimal bak…

Discussion

Här beskriver vi de protokoll för att bedöma förändringar av myofilament Ca2 ⁺ känslighet i en enda isolerad hjärt myocyte och betonar vikten av att mäta denna parameter tillsammans elektrofysiologiska egenskaper, intracellulära Ca2 ⁺ transienter, och myofilament dynamik. Detta beror på att inspelningar av en eller två av de parametrar som inte kan explicate mekanismerna bakom hjärtsammandragning och avkoppling. Till skillnad från konventionella metoder som mäter myocyte kontraktion o…

Materials

Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
		CFA300
		PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM