This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.
Hartfalen en hartritmestoornissen zijn de belangrijkste oorzaken van sterfte en ziekte wereldwijd. Toch blijft het mechanisme van de pathogenese en myocardiale storing in het zieke hart volledig worden opgehelderd. Recente overtuigend bewijs toont aan dat veranderingen in de myofilament Ca2 + gevoelige invloed intracellulair Ca2 + homeostase en ionkanaal activiteiten in cardiomyocyten, essentiële mechanismen verantwoordelijk voor de cardiale actiepotentiaal en inkrimping van gezonde en zieke harten. Sterker nog, de activiteiten van ionkanalen en transporteurs onderliggende cardiale actiepotentialen (bijvoorbeeld Na +, Ca 2+ en K + kanalen en de Na + -Ca 2+ wisselaar) en intracellulaire Ca 2+ hanteren eiwitten (bijv., Ryanodinereceptor en Ca 2+ -ATPase in sarcoplasmatisch reticulum (SERCA2a) of fosfolamban en de fosforylatie) worden gewoonlijk gemeten evaluat de fundamentele mechanismen van cardiale excitatie-contractie (EG) koppeling. Zowel elektrische activiteiten in de membraan en intracellulaire Ca2 + veranderingen de triggersignalen van EC koppeling, terwijl myofilament de functionele eenheid van samentrekking en ontspanning en myofilament Ca2 + gevoeligheid noodzakelijk is in de uitvoering van myofibril prestaties. Niettemin weinig studies nemen myofilament Ca2 + gevoeligheid in de functionele analyse van het myocardium tenzij het het focus van de studie. We beschrijven een protocol dat sarcomeer verkorting / re-verlenging en het intracellulaire Ca2 + level behulp Fura-02:00 (ratiometrische detectie) en de veranderingen van myofilament Ca2 + gevoeligheid van cardiale myocyten van ratteharten evalueren meet. Het belangrijkste doel is om te benadrukken dat myofilament Ca 2+ gevoeligheid moet in de EG-koppeling in aanmerking worden genomen voor mechanistische analyse. Uitgebreid onderzoek van de iop de kanalen, ion transporters, intracellulaire Ca 2+ handling en myofilament Ca 2+ gevoeligheid die myocyte contractiliteit in gezonde en zieke harten ten grondslag liggen zal waardevolle informatie voor het ontwerpen van meer effectieve strategieën van translationeel en therapeutische waarde.
Cardiale excitatie-contractie (EG) koppeling de grondschema voor de analyse mechanische eigenschappen van het myocardium, dwz de contractiele functie van het hart 1,2. EG koppeling wordt geïnitieerd door membraandepolarisatie secundair aan de activiteiten van sarcolemmale ionkanalen (bijvoorbeeld het spanningsgevoelige Na + kanaal, welke kan worden gemeten met patch-clamp techniek). Daaropvolgende activering van spanningsafhankelijke L-type Ca 2+ kanalen (LTCCs) en Ca 2+ influx via LTCCs leiden tot het grootste deel van Ca 2+ vrijkomen door middel van ryanodinereceptor (RyRs), het verhogen van de cytosolische Ca 2+ concentratie van het nanomolair (nM ) naar micromolair (uM) niveau. Een dergelijke verhoging van cytosolisch Ca2 + bevordert Ca2 + binding aan troponine C (TnC) in dunne filamenten en wekt conformatieveranderingen van het filament complex aan de actine-myosine interactie vergemakkelijken en bereikt myocardial contractie 3. Omgekeerd, het cytosolische Ca2 + weer wordt uptaken terug in het sarcoplasmatisch reticulum (SR) via Ca2 + -ATPase in SR (SERCA2a) of buiten de myocyten geëxtrudeerd via de Na + / Ca2 + uitwisselaar en plasmalemmal Ca2 + ATPase 1,2. Bijgevolg is de daling van cytosolische Ca2 + aanzet conformatieveranderingen van dunne filamenten terug naar de oorspronkelijke toestand, waardoor de dissociatie van actine-myosine en myocyt ontspanning 1-3. In dit schema wordt de activiteit van SERCA2a algemeen beschouwd als de snelheid van myocardiale relaxatie bepalen omdat het goed is voor 70-90% van cytosolische Ca 2 verwijderd in de meeste zoogdiercellen hartcellen 1. Als zodanig abnormale Ca 2+ behandeling door LTCC, RyR en SERCA2a, etc. werd beschouwd als de belangrijkste mechanismen voor de verminderde contractiliteit en ontspanning in het zieke hart 1-4.
<p class="jove_content"> In werkelijkheid, vrije cytosolische Ca 2+ die fungeert als de boodschapper in EC koppeling is goed voor ongeveer 1% van de totale intracellulaire Ca 2+ en de meerderheid van Ca 2+ is gebonden aan de intracellulaire Ca 2+ buffers 5,6. Dit komt door het feit dat verschillende Ca2 + buffers zijn overvloedig in cardiomyocyten, bijvoorbeeld membraanfosfolipiden, ATP, creatinefosfaat, calmoduline, parvalbumine, myofibril TnC, myosine, SERCA2a en calsequestrin de SR. 5,6,7. Onder hen, SERCA2a en TnC de overheersende Ca2 + buffers 5,6,7. Bovendien Ca2 + binding aan de buffers is een dynamisch proces in zenuwtrekking (bijvoorbeeld, 30-50% Ca2 + bindt aan TnC en losmaken van het tijdens Ca2 + transiënten 7) en de verandering in Ca2 + binding veroorzaken aanvullende "vrijgeven" van vrij Ca2 + het cytosol, leidt tot veranderingen van de intracellulaire Ca2 + concentration. Derhalve verstoring van de intracellulaire Ca2 + niveau induceert myofilament abnormale bewegingen, die de voorlopers van contractiele dysfunctie en hartritmestoornissen 8,9 zijn. Vele factoren (zowel fysiologische en pathologische) kunnen de bronnen van post-transcriptionele modificaties van myofilament eiwitten, die myofilament Ca 2+ buffering en myofilament Ca 2+ gevoeligheid 8-10 beïnvloeden. Onlangs werd gerapporteerd dat mutaties in myofilament eiwitten verhogen Ca2 + bindingsaffiniteit en intracellulaire Ca2 + handling, triggering pauze-afhankelijke versterking Ca2 + transiënten, abnormale Ca2 + afgifte, en hartritmestoornissen 8. In overeenstemming met dit concept, hebben we ook aangetoond dat myofilament Ca2 + desensibilisatie bij hypertensieve ratten harten secundair aan de up-regulatie van neuronale stikstofoxidesynthase is geassocieerd met verhoogde diastolische en systolische Ca2 + niveaus11, die op zijn beurt, verhoogt de kwetsbaarheid van de LTCC om Ca2 + -afhankelijke 12 inactivering. Daarom myofilament Ca2 + gevoeligheid is een "actieve" regelaar van intracellulair Ca2 + homeostase en myocyt contractiele functie. Het is noodzakelijk geworden om interacties tussen myofilament en Ca 2+ analyseren de behandeling van eiwitten voor grondig onderzoek van myocyten EG koppeling en hartfunctie.We beschrijven een protocol dat de veranderingen van myofilament Ca2 + gevoeligheid geïsoleerde cardiomyocyten beoordeelt. Uitgebreide analyse van de intracellulaire Ca 2+ profiel, zal myofilament Ca 2+ gevoeligheid en krimp nieuwe mechanismen ontgraven onderliggende myocard mechanica.
Hier beschrijven we de protocollen om veranderingen van myofilament Ca 2+ gevoeligheid in enkele geïsoleerde hartspiercel beoordelen en benadrukken het belang van het meten van deze parameter naast elektrofysiologische eigenschappen, intracellulaire Ca 2+ transiënten en myofilament dynamiek. Dit komt omdat de opname van een of twee van de parameters niet de onderliggende mechanismen cardiale contractie en ontspanning kan expliciteren. In tegenstelling tot conventionele werkwijzen die myocyten con…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door Basic Science Research Program door de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (2013068067); door de Brain Korea 21 Graduate Programme van het Koreaanse ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie, Seoul National University Hospital, de Koreaanse Society of Hypertension (2013), SK Telecom Research Fund (nr. 3420130290) en van de National Natural Science Foundation of China (NSFC 31.460.265; NSFC 81.260.035).
Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
NaCl | Sigma | S9625 | |
KCl | Sigma | P4504 | |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
Mannitol | Sigma | M4125 | |
MgSO4 | Sigma | M5921 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
Protease | Sigma | P6911 | |
Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
MyoCam-S Power | IonOptix | ||
Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
CFA300 | |||
PMT400 | |||
Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
Compositions of Experimental Solutions | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
Collangenase Solution 1 | |||
Isolation Solution (30mL) | |||
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
Collangenase Solution 2 | |||
Isolation Solution (20mL) | |||
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
BSA solution | |||
Isolation Solution (40mL) | |||
Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |