Korrelative lys- og elektronmikroskopi at studere microgliale Interaktioner med p-amyloid plaques
Summary
I denne artikel beskrives en protokol til visualisering amyloid Ap plaques i Alzheimers sygdom-musemodeller ved anvendelse methoxy-x 04, som krydser blod-hjerne-barrieren og selektivt binder til p-plisserede ark findes i tæt kerne Ap plaques. Det tillader præ-screening af plaque-holdige vævssnit før immunfarvning og forarbejdning til elektronmikroskopi.
Abstract
En detaljeret protokol er anført her for at identificere amyloid Ap plaques i hjernen sektioner af Alzheimers sygdom musemodeller før præ-embedding immunfarvning (specifikt for ioniseret calcium-bindende adaptormolekyle 1 (IBA1), et calcium-bindende protein udtrykt af mikroglia) og vævsbehandling for elektronmikroskopi (EM). Methoxy-x 04 er et fluorescerende farvestof, der krydser blod-hjerne-barrieren og selektivt binder til p-foldet ark findes i tæt kerne Ap plaques. Injektion af dyrene med methoxy-x 04 før aflivning og hjerne fiksering tillader pre-screening og udvælgelse af plaque-holdige hjerne sektioner for yderligere behandling med tidskrævende manipulationer. Dette er især nyttigt, når studerer tidlig AD patologi inden for specifikke områder af hjernen eller lag, der kan indeholde meget få plaques, der er til stede i kun en lille brøkdel af sektionerne. behandling af vævssnit med Congo Rød, Thioflavin S, og Thiofl Post-mortemavin T (eller endda med methoxy-x 04) kan mærke p-plisseret ark, men kræver omfattende rydning med ethanol for at fjerne overskydende farvestof og disse procedurer er uforenelige med ultrastrukturelle konservering. Det ville også være effektivt at udføre mærkning af Ap (og andre cellulære markører, såsom IBA1) på alle hjernesnit fra regioner af interesse, kun for at give en lille fraktion indeholdende Ap plaques på det rigtige sted. Vigtigere er det, Ap plaques er stadig synlige efter vævsbehandling for EM, der giver mulighed for en præcis identifikation af de områder (generelt ned til nogle få kvadratmillimeter) med elektronmikroskop til at undersøge.
Introduction
Amyloid Ap plakdannelse er det vigtigste neuropatologiske kendetegnende for Alzheimers sygdom (AD). Men stigende tyder vigtige roller i immunsystemet i sygdomsprogression 1,2. Især nye data fra prækliniske og kliniske studier etableret immun dysfunktion som en vigtigste drivkraft og bidragyder til AD patologi. Med disse resultater, har centrale og perifere immunceller dukket op som lovende terapeutiske mål for AD 3. Den følgende protokol kombinerer lys og elektronmikroskopi (EM) til at generere nye indsigter i forholdet mellem Ap plaque deposition og microgliale fænotypiske ændringer i AD. Denne protokol tillader mærkning af Ap plaques i musemodeller for AD under anvendelse af in vivo injektion af det fluorescerende farvestof methoxy-x 04. Methoxy-x 04 er en Congo Red-derivat, der let kan krydse blod-hjerne-barrieren til at indtaste hjerneparenkymet og binde β-plisserede ark med højffinity. Eftersom farvestoffet er fluorescerende, kan den anvendes til in vivo detektion af Ap plaque deposition med to-foton mikroskopi 4. Når bundet til Ap, betyder methoxy-x 04 ikke tager afstand eller videredistribuere væk fra plaques, og det bevarer sin fluorescens over tid. Det er generelt indgives perifert at muliggøre ikke-invasiv billeddannelse af hjernen dynamik 5. Fluorescensen forbliver også efter aldehyd fiksering, der giver mulighed for korrelativ post mortem-analyser, herunder undersøgelse af neuronal død i nærheden af Ap-plaques 6.
Denne protokol udnytter egenskaberne af methoxy-x 04 for at vælge hjerne sektioner fra APP SWE / PS1A 246e mus (APP-PS1, co-udtrykke en dobbelt mutation på APP genet Lys670Asn / Met671Leu, og human presenilin PS1-A264E variant) 7, der udviser Ap plaques i specifikke områder af interesse (hippocampus CA1, strata radiatum og lacunosum-moleculare) Før pre-embedding immunfarvning mod mikroglial markør ioniseret calcium-bindende adapter molekyle 1 (IBA1) at visualisere microgliale celle organer og processer med EM. Musene gives intraperitoneal injektion af methoxy-x 04-opløsning, 24 timer før hjernen fiksering gennem transcardial perfusion. Koronale hjernesnit opnås ved anvendelse af et vibratom. Sektioner indeholdende hippocampus CA1 screenes under et fluorescerende mikroskop for tilstedeværelse af Ap plaques i strata radiatum og lacunosum-moleculare. Immunfarvning for IBA1, er osmiumtetroxid post-fiksering, og plast harpiks indlejring derefter udført på de udvalgte hjernesektioner. Ved slutningen af denne protokol, kan sektionerne arkiveres uden yderligere ultrastrukturelle nedbrydning, klar til ultratynde sektionering og ultrastrukturelle undersøgelse. Vigtigere er de plaques stadig fluorescerende efter immunfarvning med forskellige antistoffer, f.eks IBA1 som i den foreliggende protokol. De bliver mørkere tHan deres omgivende neuropil efter osmiumtetroxid post-fiksering, uafhængigt af methoxy-x 04 farvning, som hjælper med at præcist at identificere de områder af interesse, generelt ned til nogle få kvadratmillimeter, der skal undersøges med transmissions elektron mikroskop.
Denne korrelative tilgang giver en effektiv måde at identificere specifikke hjerne sektioner for at undersøge på ultrastrukturelle niveau. Dette er især nyttigt, når studerer tidlig AD patologi, inden specifikke hjerneregioner eller lag, som kun indeholder nogle få Ap plaques, der er til stede i kun en lille brøkdel af vævssnit. I disse tider især, ville det være effektivt at anvende immunfarvning for Ap (og dobbelt mærkning for andre cellulære markører, såsom IBA1) på flere hjernesnit blot for at give en lille fraktion indeholdende Ap plaques på det rigtige sted. Desuden injektion af levende mus med methoxy-x 04 før aflivning og væv behandlingen ikke compromise den ultrastrukturelle konservering. Alternative metoder såsom farvning post mortem med Congo Rød, Thioflavin S, thioflavin T eller methoxy-x 04 på faste sektioner væv kræver farvning differentiering i ethanol, 8-11, som forårsager osmotiske stress og forstyrrer ultrastruktur. Congo Red er også kræftfremkaldende for mennesker 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskrives en korrelative tilgang til målretning tæt kerne Ap plaques med EM. Methoxy-x 04 in vivo injektion muliggør hurtig udvælgelse af hjernen sektioner, der indeholder Ap plaques inden for bestemte regioner og lag af interesse, for eksempel hippocampus CA1, strata radiatum, og lacunosum-moleculare. I det foreliggende eksempel blev methoxy-x 04 pre-screening kombineret med præ-indlejring immunfarvning for IBA1 at studere, hvordan forskellige microgliale fænotyper interagere med synapser …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer’s disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer’s disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -. E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -. E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. &. #. 2. 3. 2. ;. Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
