Introduction
Die Blut-Liquor - Schranke (BCSFB) ist einer der drei Sperrstellen zwischen Blut und Gehirn 1. Seine morphologische Korrelat sind die Epithelzellen des Plexus (CP) 2,3, eine endotheliale-epithelialen Konvolut, das in den Ventrikeln des Gehirns stark gefäß und befindet. Der CP dient der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), sowie zur Trennung der letzteren aus dem Blut zu erzeugen. Um die Barrierefunktion, die CP - Epithelzellen zeigen eine geringe pinozytotische Aktivität exprimieren spezifische Transporter und sind dicht verbunden durch ein kontinuierliches Netzwerk von Tight Junctions (TJs) 2,3 zu erreichen.
Menschliche Plexuspapillom (HIBCPP) Zellen, abgeleitet von einem bösartigen Plexuspapillom einer japanischen Frau 4, wurden verwendet , um einen funktionellen in vitro - Modell des BCSFB zu konstruieren. HIBCPP Zellen zeigen einige Eigenschaften eines funktions BCSFB wie die Bildung von TJStränge, die Entwicklung eines hohen transepithelialen Membranpotential, die als transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) und kleinere Permeabilitäten für Makromoleküle bestimmt werden kann. Darüber hinaus exprimieren HIBCPP Zellen charakteristische Transporter, die die ionische Mikro regulieren dienen können, und apikal / basolateralen Polarität 5,6,7 zeigen.
Die BCSFB wurde für Krankheitserreger (Bakterien, Viren und Pilze) in das zentrale Nervensystem (ZNS) 8 als Eintrittsstelle dargestellt funktionieren. Die Invasion von Krankheitserregern, einschließlich Neisseria meningitidis (N. meningitidis), ein gramnegative Bakterium, können schwere Krankheiten wie Meningitis verursachen. Der Nachweis , dass sie die Schutz epitheliale Barriere des CP überwindet , ist von histopathologischen Beobachtungen bei Patienten unterstützt mit Meningokokken - Erkrankung in den Gefäßen erhöhte Mengen an Meningokokken aufweisen und CP Epithelzellen 9,10. Um sich den Eintritt in die Wirtszellen bacteria fallen oft endozytotischen Mechanismen, die vermittelt werden, oder ausgelöst durch spezifische Oberflächenrezeptoren auf den Wirtszellen. Da Interaktionen von Pathogenen mit diesen Rezeptoren Spezies sein können spezifische 11, Tiermodelle können nur in beschränktem Umfang zu Rate gezogen werden. Die HIBCPP Zelllinie bietet die Möglichkeit, den Invasionsprozess sowie die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen im menschlichen Modellsystem zu studieren. Zellkultur-Einsätze Einsatz ermöglicht es uns, aus zwei verschiedenen Zellseiten Interaktionen von Pathogenen mit Wirtszellen zu analysieren. Viele Bakterien, einschließlich N. meningitidis, sind die Auswirkungen der Schwerkraft während der Infektion Assays stark unterworfen. Für eine optimale Wechselwirkung der Pathogene mit den HIBCPP Zellen während des Assays werden die Bakterien zunächst in das obere Kompartiment der Zellkulturfiltereinsatz System hinzugefügt. Zur Infektion von der apikalen oder der basolateralen Zellenseite ermöglichen jeweils zwei Varianten der in vitro - System gewesen ESTAblished: Im Standardsystem HIBCPP Zellen der oberen Kammer des Filtereinsatzes ausgesät, imitiert die Situation , wenn Mikroorganismen auf der CSF-Seite angeordnet sind und in Kontakt mit der apikalen Seite der Zellen (1A, C) erhalten. Im Gegensatz dazu spiegelt unter Verwendung der HIBCPP Zellen in einer umgekehrten Zellkulturfiltereinsatz System die Bedingungen, wenn Bakterien in den Blutstrom eingegeben haben. Mikroorganismen Verbreitung im Blut und Begegnung CP Epithelzellen aus der basolateralen Seite (1B, D). Bemerkenswert ist es in diesem Modellsystem wurde gezeigt , daß Bakterien eindringen HIBCPP Zellen in einem polaren Mode gezielt von der basolateralen Zellenseite 5,7.
Anschließend auf eine Infektion des CP können die Invasion von Krankheitserregern des angeborenen Immunsystems durch Ligation an Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) erkannt werden. Nun beschriebenen Mitglieder der PRRs gehören zu den Toll-like Rezeptor (TLR) -Familie. TLRs kann bind charakteristische Strukturen von infektiösen Mikroorganismen, die genannte pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) sind. Ligierung der Rezeptoren führt zur Aktivierung von Wirtszellsignalkaskaden , die Expression auslösen von Zytokinen und Chemokinen 12, die wiederum Transmigration von Immunzellen über den BCSFB 13,14 stimulieren. Es hat sich gezeigt , dass HIBCPP Zellen mehrere TLR auf mRNA - Ebene und , dass eine Infektion mit N. ausdrücken meningitidis resultiert in der Sekretion von mehreren Cytokinen und Chemokinen, einschließlich CXCL1-3, IL6, IL8 und TNFa 15,16.
Hier beschreiben wir Kultivierung und Infektion der menschlichen Zelllinie HIBCPP in einer umgekehrten Zellkultureinsatz System, das die BCSFB nachahmt. Dieses Modellsystem ermöglicht Interaktionen von Pathogenen mit der in vivo relevant basolateralen Zellenseite sowie die nachfolgende zelluläre Antwort zu studieren.
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Protocol
1. Bereiten Sie Cell Culture Filterpatronen für Seeding HIBCPP Zellen in einem Inverted Modellsystem
- Pre-warmen DMEM / F12 (Ham) mit 5 ug / ml Insulin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 10% fötalem Kälberserum (FCS).
- Verwenden einer sterilen Pinzette 0,33 cm² Wachstumsbereich Zellkulturfiltereinsätze mit einer Porengröße von 3 um den Kopf stellen, in eine 12-Well - Platte (Abbildung 1E).
- Füllmedium in das untere Kompartiment der Zellkulturfiltereinsatz (ca. 3 ml) und 100 & mgr; l auf die Oberseite des Filtereinsatzes. Flood die Platte sowie das untere Fach mit Medium. Absaugen übermäßige Medium derart , daß das untere Fach des Filtereinsatzes bleibt gefüllt (Figur 1E).
Hinweis: Es wird empfohlen, eine serologische Pipette für diesen Schritt zu verwenden. - Abdeckung 12-Well-Platte mit dem Deckel und übertragen die vorbereiteten Zellkulturfiltereinsätze in den Inkubator, 37 ° C,5% CO 2 bis zur Zugabe der Zellen.
2. Kultivierung und Passagierung von HIBCPP Zellen
- Bereiten DMEM / F12 (Ham), ergänzt mit 5 ug / ml, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 10% FCS.
- Vorwärmen Medium und PBS in einem 37 ° C Wasserbad. Absaugen Medium von Kolben. 10 ml PBS in den Kolben und wirbeln. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt.
- 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA in den Kolben und wirbeln. Legen in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2.
- Nach etwa 20 Minuten wird der Kolben aus dem Inkubator entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen aus dem Boden des Kolbens abgelöst werden und zeigen eine runde Form, wenn sie mit dem Mikroskop vermessen.
Anmerkung: Die Zellen lösen sich nicht vollständig voneinander und werden oft in Agglomerate gefunden. Es wird empfohlen, die Zellen 38 bis Passage zu verwenden. - So stoppen Sie Trypsinierung 17 ml Medium hinzu. Resuspendieren der Zellen durch Pipettieren auf und ab und übertragen die Aussetzungin einen 50-ml-Tube. Zentrifuge bei 50 × g für 10 min bei Raumtemperatur.
- Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen Medium und die Zellen durch Zählen unter Verwendung eines Hämozytometers.
Anmerkung: Die Konzentration der resuspendierten Zellen HIBCPP sollte 1 x 10 6 Zellen / ml sein. Für die Versorgung der Zellen HIBCPP wird vorgeschlagen , eine Menge von 1-6 x 10 6 Zellen in 10 ml Medium zu einem T75-Kolben zu übertragen. Ändern Medium jeden zweiten Tag.
3. Seeding Inverted Zellkulturfilterpatronen mit HIBCPP Zellen
- Auf der jeweils invertierte Filtereinsatz (dh der unteren Seite des Filters) 80 & mgr; l der Zellsuspension hinzu (dh. 8 x 10 4 Zellen) (1E).
Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Zellen gleichmäßig in der Suspension verteilt werden durch das Rohr vor der Aussaat zu invertieren. - Decken Sie die ausgesäten-Zellkulturfiltereinsätze mit dem Deckel der 12-Well-Platte und den Transfer in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2.
- Am ersten Tag, füllen 1 ml Medium in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Heben Sie die Zellkulturfiltereinsätze mit einer Pinzette aus der 12-Well - Platte verwenden, entsorgen Sie das Medium nach innen, drehen Sie die Filtereinsätze und legen Sie sie in der Standard - Orientierung in die vorbereitete 24-Well - Platte (Abbildung 1E).
- jeden zweiten Tag Legen Sie die Zellen in frisches Medium. Bereiten Sie 24-Brunnen mit frischem Medium und übertragen Sie die Filtereinsätze zu. Füllen Einsätze mit 0,5 ml frisches Medium. Überprüfen Sie TEER jeden Tag, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
- Wenn TEER-Werte von HIBCPP ausgesät-Zellen auf Zellkultureinsätzen über 70 Ω x cm² (etwa 4 Tage nach dem Aussäen), dann wird der Zellkultur in Medium weiterhin enthaltend 1% FCS und 5 & mgr; g / ml Insulin. Bereiten Platten mit 24 Vertiefungen mit 1 ml Medium für jede Vertiefung. Übertragen Filtereinsätze auf die vorbereiteten Kavitäten und Austauschmedium in der oberen Kammer.
Anmerkung: Diese Serumentzug nach Konfluenz führt zur Bildung voneine höhere Membranpotential. - Absaugen Medium aus dem Filterfach, Transfer zum gut vorbereitet und mit 500 & mgr; l Medium zu füllen. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. Setzen Sie die Zellen über Nacht in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2.
4. Messung der transepitheliale Elektrischer Widerstand (TEER)
- Tauchen Sie die Elektrodenspitzen von Epithelgewebe Cell 15 min in 80% Ethanol. Übertragen Cell unter der Haube und lassen Elektrode trocken für einen Moment. Platzieren Elektrode in entsprechende Kulturmedium für die Zellen für weitere 15 min verwendet zu äquilibrieren.
- Messungen durchführen, indem Sie den längeren Arm der Elektrode so, dass sie den Boden der unteren Kammer jedes Mal berührt, stellen Sie den kürzeren Arm in den Filtereinsatz Fach.
Hinweis: Die Widerstandswerte von Zellkulturfiltereinsätze ohne Zellen in Medium sollte als Blindwerte verwendet werden ((Messwert (Ω) - Blindwert (Ω)) x FilterOberfläche (dh 0,33 cm²)). - Ort der Elektrode wieder in 80% Ethanol für 15 min Nach der Messung. An einem trockenen Rohr.
5. Bestimmung der parazelluläre Permeabilität
- Man löst 1 g FITC-Inulin in 200 ml Kulturmedium mit 5 ug / ml Insulin 1% FCS ergänzt. Anwenden 50 ug / ml der Lösung in das obere Filterabteil vor der Infektion der Zellen.
- Nach der Infektion sammeln Mediumproben aus dem unteren und um zu bestimmen, wie viel Inulin aus der Filterkammer durch die Zellschicht geleitet.
- Bereiten Sie eine FITC-Inulin Standardlösung und führen 1: 2-Verdünnungen, 10-mal (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% und 0%) . Bestimmen Sie Fluoreszenz durch Messung aller Proben in Mikrotiterplatten-Lesegerät.
6. Herstellung von Bakterien zur Infektion von HIBCPP Zellen auf Zellkulturfilterpatronen
- Einen Tag vor dem Experiment, schaben ter gefroren N. meningitidis - Stämme mit einem Glycerin-Lager und Streifen aus auf Schokolade - Agar mit Vitox ab. Wachsen über Nacht in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Auszug 20-30 Kolonien aus der Nachtkultur und Transfer in ein Röhrchen mit 8 ml Proteosepepton Medium ergänzt mit 0,042% NaHCO 3, 0,01 M MgCl 2 und 1% PolyViteX.
- Schütteln, um die Bakterien für 1,25 Stunden bei 220 rpm, 37 ° C. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 2.684 g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und resuspendieren das Bakterienpellet mit 8 ml serumfreiem Medium. Vortex eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten.
- Zu Kulturdichte bestimmen, wird eine Verdünnung von 1:10 bei einer optischen Dichte (OD) von 600 nm zu messen. Stellen Sie die Bakteriensuspension auf eine OD 600 von 0,1.
Hinweis: Diese Suspension ca. enthält. 1 x 10 8 CFU / ml. - Um die Bakterienzellkonzentration bestätigen, verdünnte die Suspension schrittweise (1:10) bis zu einerVerdünnung von 10 -5 und Platte auf Schokoladen - Agar - Platten.
Anmerkung: Ähnliche Verdünnungsreihen durchgeführt werden müssen Bakterienwachstumskurven zu berechnen.
7. Die Infektion von HIBCPP Zellen auf Zellkulturfilterpatronen und Bestimmung der bakteriellen Invasion durch Doppelimmunfluoreszenz
- Nachdem weiterhin eine epitheliale Gewebe unter Verwendung Cell-Zellkultur in Medium mit 1% FCS und 5 & mgr; g / ml Insulin, täglich Zellen messen. Wenn Zellen, die einen TEER von etwa 500 Ω x cm² erreicht haben, tragen die Infektion aus.
- Infizieren , die Zellen mit der hergestellten Bakteriensuspension bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10. Bewahren die infizierten Zellen in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für den angegebenen Zeitraum.
Hinweis: Das MOI kann durch Berücksichtigung der Anzahl der Zellen pro Zellkulturfiltereinsatz bei Konfluenz (1,21 x 10 6 Zellen / cm 2) berechnet werden. - Stoppen Sie den InfektIons durch dreimal mit 500 & mgr; l serumfreiem Medium (SFM), enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) in die Filterkammer Waschen angewendet, 1 ml zu dem unteren Abteil.
- Blockieren mit 500 ul SFM, das 1% BSA-Puffer in dem Filterfach und 1 ml in der unteren Kammer 20 min bei Raumtemperatur Anhaftung von Antikörpern gegen unspezifische Bindungsstellen zu verhindern.
- Inkubieren mit 100 & mgr; l primärer Antikörper anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) in dem Filterraum und 500 & mgr; l in der unteren Kammer für 20 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss. - Waschen Sie die Zellen, die durch das Medium aus dem Filterfach Absaugen, übertragen Sie den Filtereinsatz mit einem gut vorbereitet mit 1 ml SFM, die 1% BSA und füllen Sie den entleerten Filterfach mit 500 & mgr; l SFM 1% BSA enthielt. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt.
- Fix-Zellen mit 500 ul 4% Formaldehyd in dem Filter compartment, 1 ml in der unteren Kammer für 10 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen, die durch das Medium aus dem Filterfach Absaugen, übertragen Sie den Filtereinsatz mit einem gut vorbereitet mit 1 ml PBS und füllen Sie den entleerten Filterfach mit 500 ul PBS. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt.
Anmerkung: Die Proben können über Nacht in PBS bei 4 ° C gelagert werden. - Cut feste Zellkultur filtert der Einsätze aus und waschen mit 250 ul PBS 1% BSA enthält. Inkubiere Zellen für 15 min bei Raumtemperatur mit 250 ul markiertem fluoreszierend (Anregungswellenlänge 594 nm) sekundären Antikörper Huhn-anti-Kaninchen (1: 500), extrazelluläre Bakterien zu färben.
Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss. - Permeabilisieren Zellen mit 250 ul PBS, enthaltend 1% BSA und 0,5% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Zellen dreimal mit 250 ul PBS, das 1% BSA enthält.
- Inkubieren mit 250 & mgr; l primärer Antikörper anti N. meningitidis
- Anwenden 250 ul fluoreszenzmarkierten (Anregungswellenlänge 488 nm) sekundärer Antikörper (1: 500), gekennzeichnet fluoreszierend (Anregungswellenlänge 660 nm) Phalloidin (1: 250) und 4', 6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI) ( 1: 50.000) 1 h lang bei Raumtemperatur zu färben extra- und intrazellulären Bakterien, Aktin-Zytoskelett und Kerne.
Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss. - Waschen Zellen dreimal mit 250 ul PBS, das 1% BSA enthält. Einbetten der Zellen Medium und lagern bei 4 ° C bis zur Untersuchung über Mikroskop bei der Montage.
- Bestimmen Sie Anzahl der Invasion Bakterien pro vordefinierten Feld. Tun Sie dies durch 20 Felder pro Filtermembran zu zählen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Invasion Bakterien.
Hinweis: Multiplizieren Sie die mittlere Keimzahl in den 20 mikroskopischen Feldern mit einer Fläche zientient. Das Ergebnis drückt die Menge der gesamten Bakterien in einer 0,33 cm² Zellkulturfiltereinsatz. Diesen Wert durch die Menge der Bakterien in Medien während der Dauer der Infektion gezüchtet.
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Representative Results
Hier beschreiben wir die Kultivierung und Infektion von HIBCPP Zellen in einer umgekehrten Zellkultureinsatz System. Dieses Modell ermöglicht es uns Invasionsmechanismen und die zugrunde liegenden molekularen Signalwege von der basolateralen Zellseite zu studieren, eine physiologische Situation von Bakterien reproduzieren Verbreitung und Epithelzellen über den Blutstrom (Abbildung 1) eingeben.
Die HIBCPP Zellen zeigen gewisse Barrierefunktionen, die es ihnen ermöglichen molekularen Austausch auf ein minimales Niveau zu beschränken. Dies wird durch die Expression von adherens junction (AJ) und Tight junction (TJ) Proteine erreicht. Immunofluoreszenz - Analyse der TJ-assoziierten Proteinen Occludin, Claudin und ZO-1 ergab ein ununterbrochenes Signal an den Stellen der Zell-Zell - Kontakt, was zeigt , dass die Zellen durch kontinuierliche Stränge TJs (2A, B, C) miteinander verbunden sind. Eine detaillierte Eindruck von ter TJ Morphologie wurde durch Übertragung (2D) und Gefrierbruch - Elektronenmikroskopie (Abbildung 2E) erhalten, was zeigt , dass TJs zwischen den Zellen angeordnet sind und bilden breite, vermaschten kabelartigen Strukturen.
TJs von Epithelzellen wirken auch als Zaun apikalen und basolateralen Membrandomänen zu trennen, damit die zelluläre Polarität beitragen. Unter den Proteinen, die ausschließlich auf der basolateralen Zellseite HIBCPP Zellen exprimiert werden, sind die AJ - Protein E-Cadherin (Ecad) und Hepatozyten - Wachstumsfaktor - Rezeptor (HGF / Met) als 3 durch Immunofluoreszenz - Analyse gezeigt wird , um eine Zeige gewisses Maß an Polarität.
Wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert HIBCPP Zellen weisen auch typischen Barrierefunktionen der BCSFB wie Bildung eines Membranpotentials sowie eine geringe Durchlässigkeit für macromolecules. Bestimmung der Membranpotentials kann durch Messung des TEER mit der Verwendung eines Cell erreicht werden. Die Durchlässigkeit der Zellschicht durch Anwendung von FITC-markiertem Inulin, einem Zucker quantifiziert, die die Schicht in einem parazellulären Mode übergeht. Hier zeigen wir Ergebnisse einer repräsentativen Experiment, das zeigt, dass diese Barrierefunktionen bleiben stabil und zeigen keine Neigung von Standard-Konzentrationen von Dimethylsulfoxid (DMSO), einem gemeinsamen Lösungsmittel für zellstimulierende Chemikalien. Wie in 4A zu sehen ist, wurden TEER - Werte vor und nach der Exposition der Zellen zu HIBCPP DMSO aufgezeichnet.
Die Zellen zeigten eine hohe Membranpotential, die für alle Bedingungen zu Beginn des Experiments bis etwa 500 Ω x cm² erreicht werden. Die gemessene TEER nicht für Zellen nach 2 Stunden ändern mit bis zu 0,2 Vol% DMSO behandelt. Im Gegensatz dazu verringerte TEER-Werte in einer dosisabhängigen Weise when höhere Volumina (4A) angewendet wurden. Diese Verringerung der Membranpotential war gleichzeitig mit einer erhöhten Permeabilität für Makromoleküle. Während die Zugabe von DMSO zu HIBCPP Zellen bis zu 0,5 Vol-% nicht in einer Permeabilität für Inulin Anstieg geführt haben, 1 vol% bis 2 vol% zeigte einen Effekt, wenn auch in einem begrenzten Ausmaß (4B). Weiterhin überprüften wir den Einfluss von Cytochalasin D, ein potenter Inhibitor der Aktin-Polymerisation, auf das Membranpotential und die Permeabilität von HIBCPP Zellen. Behandlung der Zellen mit 1 & mgr; g / ml Cytochalasin D bewirkt einen deutlichen Abfall der TEER - Werte sowie eine Erhöhung der FITC-Inulin Flußmittel (4A, B). Dieser Effekt kann durch Cytochalasin D., die durch die Öffnung der TJs erklärt werden
Die HIBCPP Zelllinie als Modell des BCSFB kann zu studieren Interaktionen von Pathogenen verwendet werden und die Barriere bildenden Epithelzellen. Es gibt Beweisedass das Bakterium N. meningitidis gewinnt den Eintritt in das ZNS durch die BCSFB Kreuzung. Es hat sich gezeigt , daß Neisseria HIBCPP Zellen von der basolateralen Seite Zelle spezifisch eindringen, die in vivo relevant ist. Während dieses Prozesses spielt die bakterielle Kapsel eine wichtige Rolle: Kapsel fehlt Mutanten zeigen eine erhöhte Invasion in HIBCPP Zellen 5. Im Folgenden werden wir basolateralen Invasion der MC58 - Stamm 17, seine isogene Mutante MC58siaD verglichen - defizienten für die Kapselproduktion 17 und dem nicht eingekapselten Träger isolieren α14 19,20. HIBCPP Zellen wurden mit den Stämmen infiziert oben erwähnt über einen zeitlichen Verlauf von 4 Stunden bei einer MOI von 10. Immunofluoreszenz - Analyse ergab signifikante invasion für die beiden pathogenen Stämmen MC58 und MC58siaD -, wohingegen nur geringe Invasion Raten für die apathogenen α14 Stamm beobachtet wurden ( 5A). Ein repräsentatives Bild des Doppel immunofluFluoreszenz - Mikroskopie von HIBCPP Zellen mit dem jeweiligen Stamm infiziert ist in 5A, B und C gezeigt.
Abb . 1: Standard and Inverted Zellkultur in einem Standardzellkultursystems (A, C) Interaktion von Bakterien mit den CP Epithelzellen an der apikalen Zellseite untersucht werden, die von Mikrovilli angedeutet ist. Das invertierte Zellkultursystems (B, D) ermöglicht es uns , bakterielle Wechselwirkung mit der basolateralen Zellmembran zu untersuchen, die während einer bakteriellen Invasion über den Blutstrom in das ZNS beteiligt ist. Für das invertierte Zellkultur (E) HIBCPP Zellen werden auf der Bodenseite der Filtereinsätze beimpft. Die untere und einschließlich der inneren Kammer des Filtereinsatzes sind mit Medium geflutet. Subsequhängig wird die übermäßige Medium so angesaugt, daß der Innenraum des Filtereinsatzes gefüllt bleibt. Am ersten Tag nach dem Aussäen Zellkulturfiltereinsätze werden umgedreht und mit Medium gefüllt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. HIBCPP Zellen anzeigen Kontinuierliche Strands von TJs Die TJ - Proteine ZO-1 (A), Occludin (B) und Claudin-1 (C) wurden in HIBCPP Zellen nachgewiesen. Panels AC zeigen Apotome Bilder. Mitte jeder Platte: xy en face Ansicht der Zellen; oben und rechts: Querschnitte mehrerer optischer Schnitte durch das z -Ebene. Maßstabsbalken zeigen 10 & mgr; m. Die TJ Struktur von HIBCPP Zellen wurde durch Übertra analysiertsion Elektronenmikroskopie. Zellen sind miteinander verbunden durch TJs, die durch die Pfeile (D) angegeben sind. Der Maßstab zeigt 1 um. Gefrierbruch - Elektronenmikroskopie Studien visualisieren engmaschiges TJ - Stränge (E). Der Maßstabsbalken = 0,5 um. Die Bilder in dieser Figur wurden ursprünglich in Schwerk veröffentlicht et al, PLoS One 7: e30069, doi:. 10.1371 / journal.pone.0030069 (2012); Re-Print mit freundlicher Genehmigung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Die Expression von Rezeptorproteinen beteiligt Während Invasion von Bakterien in HIBCPP Zellen Immunfluoreszenz - Analyse zeigt die Expression von Ecad (A) und Met (B) an der basolateralen Zellseite.. Die pictures zeigen Apotome Bilder. Mitte jeder Platte: xy en face Ansicht der Zellen; oben und rechts: Querschnitt mehrerer optischer Schnitte durch das z -Ebene. Der apikalen Membran der HIBCPP Zellen (durch Pfeile angedeutet) wird in Richtung der Oberseite des Oberteils als auch gegenüber der rechten Seite der rechten Seite positioniert ist, jeweils eines jeden Rahmens. Maßstabsbalken = 10 um. Die Daten in dieser Figur wurden auch vorher in Gründler et al, Microbes Infect 15: 291-301, doi:.. 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); Re-Print mit freundlicher Genehmigung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Einfluss von DMSO und Cytochalasin D auf Barrierefunktion HIBCPP Zellen Auswirkungen auf die Barriere - Funk.tion werden durch Messung der TEER-Werte und FITC-Inulin-Flux bestimmt. Ergebnisse werden für ein repräsentatives Experiment gezeigt, die in dreifacher Ausführung durchgeführt wurde. HIBCPP Zellen wurden mit DMSO sowie Cytochlalasin D in den angegebenen Mengen für 2 Stunden behandelt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Wenn sie in Konzentrationen bis zu 0,2 Vol-% aufgetragen, DMSO hat keine Auswirkung auf das Membranpotential (4A). Konzentrationen im Bereich von 0,1 vol% bis 0,5 vol% des DMSO beeinflussen auch nicht parazelluläre Permeabilität der Zellen (4B). Im Gegensatz, 1 & mgr; g / ml Cytochalasin D verursacht eine Abnahme in TEER gleichzeitig mit einem Anstieg in FITC-Inulin-Flux durch die Zellschicht (4A, B).
Abbildung 5: Invasion von N. meningitidis in HIBCPP Zellen. Doppelimmunfluoreszenzmikroskopie zeigt eingedrungen (grün) und verklebt (gelb) Bakterien. Weiße Kästen innerhalb von Bildern repräsentieren den vergrößerten Bildausschnitt auf der rechten Seite. Basolateralen Invasion wurde für die N. beobachtet MC58 meningitidis - Stämme (A) und MC58siaD -, mangelhaft für die Kapselproduktion (B), während nur eine geringe Invasion Rate für α14 (C) bestimmt. Das Diagramm zeigt , dass die Invasion Raten von MC58 und MC58siaD - von großer Bedeutung sind , wenn sie im Vergleich zu α14 (**, p <0,01). Extreme Bedeutung wird angezeigt, wenn MC58 oder MC58siaD - jeweils mit α14 verglichen wurden (***, p <0,001) und MC58siaD - wurde im Vergleich zu MC58 (###, p <0,001). Maßstabsbalken indicate 10 um. . Das Diagramm in D wurde ursprünglich in Borkowski veröffentlicht et al, J Neuroinflammation 11: 163, doi: 10.1186 / s12974-014-0163-x (2014); Re-Print mit freundlicher Genehmigung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Epithelzellen des CP bilden die BCSFB, die die CSF aus dem Blut 2,3 trennt. Wir stellten kürzlich die HIBCPP Zelllinie als funktionelles menschliches Modell des BCSFB. Die Zellen zeigen wichtige Barrierefunktionen der BCSFB in vitro, einschließlich der Entwicklung eines hohen Membranpotential, eine geringe Permeabilität für Makromoleküle sowie die Anwesenheit von kontinuierlichen Strängen von TJs 5. Die TJ-Proteine tragen zu einem apikalen / basolateralen Polarität der Zellen. Die Polarität ist von hoher Bedeutung für eine gezielte Lokalisierung von Oberflächenrezeptoren sowie spezifische Transportproteine. Wir haben sowie Mitglieder der ATP-bindenden Kassette (ABC) Transporterfamilie polare Lokalisation der Rezeptoren Ecad und Met gezeigt , die eine stark kontrollierte Mikroumgebung innerhalb des ZNS 6,7 aufrechterhält.
Es gibt mehrere Mikroorganismen in der Lage sind den Eintritt in das ZNS zu gewinnen, indem sie die BCSFB überwinden, leading schwere Erkrankung einschließlich Meningitis 8. Einer der Pathogene , die von eindringenden in CP Epithelzellen fähig sind , ist der menschliche spezifische Gram-negative Bakterium N. meningitidis 9,10, die HIBCPP Zellen in einem polaren Art und Weise gezeigt wurde , von der basolateralen Zell Seite 5 speziell einzugeben. Dies ist der physiologisch relevanten Richtung zur Infektion des Gehirns über die BCSFB wenn Bakterien verbreiten und Begegnung epithelialen Zellen CP aus dem Blut im Verlauf von Meningitis. Um diese Situation in vitro reflektiert werden HIBCPP Zellen auf der unteren Seite des Filters angewachsen. Im Gegensatz zu den Standardeinsatz Modellfilter, wo Zellen in der oberen Kammer ausgesät werden, dieser Satz aus einem umgekehrten Kultursystem ermöglicht Epithelzellen spezifisch von der basolateralen Zellseite 5,21 zu infizieren.
Basolateralen Invasion in HIBCPP Zellen wurde für die beiden pathogenen N. beobachtet meningitidis -, während die nicht-pathogenen Träger isolieren angezeigt α14 nur marginal Invasion 15. Dies zeigt, dass die HIBCPP Zellmodell die Möglichkeit bietet, zur Verfügung Mutantenbibliotheken für neue Virulenzfaktoren während der Invasion beteiligt zu scannen. Bemerkenswert ist es , dass auch andere Krankheitserreger einschließlich L. nachgewiesen monocytogenes und Streptococcus suis (S. suis) HIBCPP Zellen in einem polaren Art und Weise 5,7 einzudringen.
Um eindringende Mikroorganismen in das ZNS, die Epithelzellen des CP exprimieren PRRs 22,23 zu erkennen und darauf zu reagieren. TLRs sind eine wichtige Familie innerhalb der PRRs. Qualitative RT-PCR - Analysen zeigten , dass HIBCPP Zellen mehrere TLR sowie verwandten Co-Rezeptoren und das Adaptermolekül MyD88 15 auszudrücken. Es wurde beobachtet , dass die Rezeptoren TLR2 und TLR4 in der zellulären Abwehrreaktion beteiligt sind N. meningitidis Kapselpolysaccharide 24. Weitere Ergebnisse eines Mikroarrays Ansatz ergab , dass HIBCPP Zellen mit N. infiziert meningitidis eine Induktion von Signaltransduktionswege zeigen, was unter anderem auch den Transkriptionsregulator Einbeziehung IκBζ 15, obligatorisch für die Expression bestimmter Zielgene einschließlich IL - 6 25,26, pro-inflammatorischen Zytokins.
Um zu bestätigen diese Ergebnisse, infizierte HIBCPP Zellen mit N. meningitidis in einer umgekehrten Kultursystem benutzt wurden , um die Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen zu untersuchen. Es ist bekannt , daß dieses Verfahren zielt darauf ab , eine Entzündungsreaktion durch Aktivierung des angeborenen Immunsystems 13,14 einzuleiten. HIBCPP Zellen produzieren und Zytokine und Chemokine, einschließlich CXCL1-3, IL6, IL8 und TNFa 15,16, die beschrieben wurden , zu gewinnen Neutrophilen und Monozyten 27 sezernieren. Mit unserem Modellsystem verwendet wirdfestgestellt , dass polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten, Monozyten und auch T - Lymphozyten wandern durch HIBCPP Zellen 16,28 und betonte , dass HIBCPP Zellen für die Entschlüsselung Mechanismen der transepithelialen Migration von Immunzellen geeignet sind.
Die hier vorgestellten Modellsystem bietet auch die Möglichkeit für Änderungen. HIBCPP Zellen können mit Antikörpern oder chemischen Inhibitoren vorbehandelt werden, Rezeptoren zu identifizieren und Signalwege Transduktion bei der Infektion beteiligt sind. DMSO, ein gemeinsames Lösungsmittel für zellstimulierenden Reagenzien können in geeigneten Mengen zu den HIBCPP Zellen, die Funktionen stabile Barriere Anzeige angelegt werden, die nicht durch die chemische im gesamten untersuchten Zeitverlauf beeinflusst. Diese Eigenschaft ist auch relevant für die Verwendung des Modells in pharmazeutischen Studien.
Obwohl wir , dass HIBCPP Zellen einen gewissen Grad an Polarität zeigen unter Beweis gestellt haben, werden sie natürlich nicht jedes einzelne Detail eines in - vivo - Modell reflektieren. <em> zB die Lokalisation von ABC - Transporter Familienmitglieder entspricht nur zum Teil die erwarteten Muster 6, warum pharmazeutische Anwendungen können sich wahrscheinlich nur in eingeschränktem Umfang angewendet werden. Auch scheinen die HIBCPP Zellen nicht CSF (Daten nicht gezeigt) zu erzeugen. Trotzdem haben wir festgestellt , dass HIBCPP Zellen , die Proteine Transthyretin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 2 (IGF2) und forkhead box J1 (FOXJ1) auf RNA - Ebene 5, exprimieren , die 29,30,31,32 charakteristische Markerproteine für CP Epithelzellen . Diese Beobachtung unterstützt, dass HIBCPP Zellen typische Eigenschaften von CP Epithelzellen beibehalten haben. Wichtig ist, darauf hinzuweisen, dass HIBCPP Zellen nicht vorhanden Kontakthemmung tun. Es ist daher entscheidend, um die Zellen für Experimente zu verwenden, wenn entsprechende TEER-Werte erreicht werden. Darüber hinaus sollte die HIBCPP Zellen nicht über Durchgang 38, da das Potential verwendet werden, um eine Sperrfunktion zu entwickeln scheint mit höheren Durchgänge fallen. Schließlich studieren die impAkt der Zell-Zell-Interaktionen bei Infektionen an der BCSFB eine Co-Kultur-Modell CP epithelialen und endothelialen bestehend wäre von großem Interesse sein, aber ein solches Modell muss noch weiterentwickelt werden.
Abschließend kann die HIBCPP Zellkulturmodell verwendet werden, um Schlüssel Invasion Wege und die zugrunde liegenden Signalwege, insbesondere von menschlichen spezifischen Krankheitserreger an der BCSFB offenbaren. Da bekannt ist , dass die Epithelzellen des CP sind auch bei neurologischen degenerativen Erkrankungen wie Alzheimer - Erkrankung sowie Multiple - Sklerose - 2 beteiligt, und auch in Gehirn Metastasierung von Tumorzellen 33, bietet das System im Allgemeinen eine große Vielfalt an Möglichkeiten zur Untersuchung von krankheitsbezogenen Mechanismen und bietet das Potenzial, neue therapeutische Targets zu finden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
