Introduction
המכשול נוזל המוח והשדרה דם (BCSFB) הוא אחד האתרים שלושה מחסום בין הדם למוח 1. לתאם מורפולוגיים שלו הם תאי אפיתל של המקלעת דמה (CP) 2,3, גידול convolute האנדותל אפיתל, המהווה כלי דם מאוד וממוקם החדרים של המוח. המחסום משמש כדי לייצר את הנוזל השדרתי (CSF) וכן להפריד האחרון מהדם. על מנת להשיג תפקוד מחסום, לתאי האפיתל CP להראות פעילות pinocytotic נמוכה, להביע מובילים ספציפיים, ומחוברים בצפיפות על ידי רשת רציפה של צומת הדוקים (TJS) 2,3.
הפפילומה מקלעת דמה עין אנושית (HIBCPP) תאים, נגזרים הפפילומה מקלעת דמה ממאיר של אישה 4 יפנית, ששמשו לבנייה פונקציונלית במודל חוץ גופייה של BCSFB. תאי HIBCPP להראות כמה מאפיינים של BCSFB פונקציונלי כמו ההיווצרות של TJגדילים, התפתחות של פוטנציאל הממברנה transepithelial גבוהה כי ניתן לקבוע ההתנגדות החשמלית transepithelial (TEER), ו permeabilities מינור מקרומולקולות. יתר על כן, תאי HIBCPP להביע מובילי מאפיין, אשר יכול לשמש כדי לווסת את המיקרו-הסביבה היונית, ולהראות פסגה / 5,6,7 קוטביויות basolateral.
BCSFB הוכח לתפקד כאתר כניסה פתוגנים (חיידקים, וירוסים ופטריות) במערכת העצבים המרכזית (CNS) 8. הפלישה של פתוגנים, לרבות meningitidis Neisseria (meningitidis נ), חיידק גראם שלילי, יכולה לגרום למחלות קשות כמו דלקת קרום המוח. עדות לכך שהוא מתגבר על מחסום ההגנה האפיתל של CP נתמכת על ידי תצפיות histopathological בחולים עם מחלת קרום המוח מציגה כמויות מוגברות של meningococci על כלי הדם לתאי האפיתל CP 9,10. כדי לזכות כניסת ba תאי מארחיםcteria לעתים קרובות לחטוף מנגנוני endocytotic, אשר מתווכים או מופעלים על ידי קולטנים משטח ספציפיים הממוקמים על תאי מארחים. מאז אינטראקציות של פתוגנים עם קולטנים אלה יכולים להיות מינים ספציפיים 11, במודלים של בעלי חיים ניתן להתייעץ רק במידה מוגבלת. השורה תא HIBCPP מספק הזדמנות ללמוד את תהליך הפלישה כמו גם את המנגנונים המולקולריים שבבסיס בתוך מודל המערכת האנושית. העסקה מוסיפה תרבית תאים מאפשרת לנתח אינטראקציות של פתוגנים עם תאי מארחים משני צדדי תא ברורים. חיידקים רבים, נ כולל meningitidis, כפופים בחריפות את השפעת הכבידה במהלך מבחני זיהום. עבור אינטראקציה אופטימלית של פתוגנים עם תאי HIBCPP במהלך המבחנים, החיידקים בתחילה מתווספים לתוך התא העליון של מערכת כנס מסנן תרבית תאים. כדי לאפשר זיהום מן הפסגה או בצד התא basolateral, בהתאמה, שתי וריאציות של מערכת במבחנה כבר established: במערכת תקן תאי HIBCPP הם זורעים לתוך התא העליון של הכנס המסנן, מחקו את המצב כאשר מיקרואורגניזמים נמצאים על CSF בצד ולקבל במגע עם צד apical של התאים (איור 1 א, ג). לעומת זאת, תוך שימוש בתאי HIBCPP במערכת כנס מסנן תרבית תאים הפוכה משקף את התנאים כאשר חיידקים נכנסו לזרם הדם. מיקרואורגניזמים להפיץ את CP דם המפגש לתאי האפיתל מהצד basolateral (איור 1 ב ', ד'). ראויים לציון, במערכת מודל זה הוכח כי חיידקים לפלוש תאי HIBCPP באופן קוטבי במיוחד מן 5,7 בצד התא basolateral.
בהמשך לזיהום של CP, הפתוגנים פלשו יכולים להיות מוכר על ידי מערכת החיסון המולדת באמצעות קשירה לקולטנים-זיהוי תבניות (PRRs). היטב תיאר חברי PRRs שייכים קולטן דמוי אגרה (TLR) המשפחה. TLRs יכול binד למבנים מאפיינים של מיקרואורגניזמים זיהומיות, אשר דפוסים מולקולריים הפתוגן קשור termed (PAMPs). קשירה של הקולטניים מובילה הפעלה של תא מארח איתות מפלי המפעילות ביטוי של ציטוקינים כמוקינים 12, אשר בתורו לגרות גלגול של תאי מערכת חיסון על פני 13,14 BCSFB. הוכח כי תאי HIBCPP להביע כמה TLRs ברמה mRNA וזיהום כי עם נ meningitidis התוצאה הפרשת ציטוקינים כמה וכמוקינים, כולל CXCL1-3, IL6, IL8 ו TNFα 15,16.
כאן אנו מתארים טיפוח וזיהום של קו תאים אנושיים HIBCPP במערכת להכניס תרבית תאים הפוכה המחקה את BCSFB. מערכת מודל זה מאפשרת ללמוד אינטראקציות של פתוגנים עם צד תא basolateral vivo ב רלוונטי וכן את תגובת התאים הבאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכין הוספת מסנן תרבית תאים עבור תאי המתזמן HIBCPP ב מערכת מודל הפוך
- טרום חם DMEM / F12 (Ham) בתוספת 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו -10% עוברי עגל בסרום (FCS).
- שימוש במלקחיים סטרילי כדי למקם מוסיף מסנן תרבית תאים 0.33 סמ"ר הצמיחה באזור עם גודל הנקבוביות של 3 מיקרומטר במהופך לתוך צלחת 12-היטב (איור 1E).
- מלאו בינוניים לתוך המגירה התחתונה של כנס מסנן תרבית תאים (כ -3 מיליליטר) ו -100 μl על גבי להכניס את המסנן. להציף את הצלחת כמו גם בתא התחתון עם מדיום. לשאוב את המדיום מוגזם בצורה כזאת כי בתא התחתון של להכניס מסנן נשאר מלא (1E איור).
הערה: מומלץ להשתמש פיפטה סרולוגיות עבור שלב זה. - מכסים בצלחת 12-היטב עם המכסה ולהעביר מחדיר מסנן תרבית תאים מוכן בחממה, 37 ° C,5% CO 2 עד תוספת של תאים.
טיפוח 2. Passaging של תאים HIBCPP
- הכן DMEM / F12 (Ham) בתוספת 5 מיקרוגרם / מ"ל, 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל ו -10% FCS.
- בינוני טרום חם PBS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לשאוב בינוני מן הבקבוק. הוסף 10 מ"ל PBS על הבקבוק ו מערבולת. חזור על פעולה זו פעם.
- הוסף 3 מ"ל 0.25% טריפסין-EDTA אל הבקבוק מערבולת. מניחים לתוך החממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר כ -20 דקות להסיר את הבקבוק מן החממה. ודא כי התאים מנותקים מהחלק התחתון של הבקבוק ולהציג צורה עגולה כאשר שנסקרו עם המיקרוסקופ.
הערה: התאים לא לנתק לחלוטין זה מזה נמצאים בדרך כלל agglomerates. מומלץ להשתמש בתאים עד חלוף 38. - כדי להפסיק trypsinization להוסיף 17 מ"ל בינוני. Resuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהעביר את ההשעיהלתוך צינור 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 50 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- Resuspend התאים נפח מתאים של המדיום לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
הערה: ריכוז תאי HIBCPP resuspended צריך להיות 1 x 10 6 תאים / מ"ל. עבור תחזוקה של תאים HIBCPP הוא הציע להעביר סכום של 1-6 x 10 6 תאים 10 מ"ל בינוני עד א-בבקבוק T75. שנה בינונית כל שני וחמישי.
3. מתזמן Inverted נייד הוספת מסנן תרבות עם תאי HIBCPP
- בראש כל כנס מסנן הפוך (כלומר בצד התחתון של המסנן) להוסיף 80 μl של השעית תא (כלומר. 8 x 10 4 תאים) (איור 1E).
הערה: ודא כי התאים מופצים בצורה אחידה בתוך ההשעיה על ידי צינור היפוך לפני הזריעה. - מכסה את מוסיף מסנן התרבות הזורע תאים עם המכסה של הצלחת 12-היטב ולהעביר בחממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- ביום הראשון, למלא 1 בינוני מ"ל לתוך הבארות של צלחת 24 גם. הרם את מוסיף מסנן תרבית תאים באמצעות מלקחיים מתוך צלחת 12-היטב, להשליך את המדיום פנימה, להדליק את מוסיף מסנן ומניחים אותם בכיוון סטנדרטי לתוך צלחת 24 גם מוכן (איור 1E).
- מניחים את התאים לתוך מדיום חדש כל שני וחמישי. כן 24 בארות עם מדיום חדש ולהעביר את מוסיף המסנן אליו. מלאו מוסיף עם מדיום חדש 0.5 מ"ל. בדוק TEER כל יום כמפורט בסעיף 4.
- כאשר ערכים TEER של תאים שנזרעו HIBCPP על מוסיף תרבית תאים עולה 70 Ω x סמ"ר (כ 4 ימים לאחר הזריעה), ולאחר מכן להמשיך תרבית תאים במדיום המכיל FCS 1% ו 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין. הכן 24 גם צלחות עם המדיום 1 מ"ל לכל היטב. העבר מוסיף מסנן על הבארות המוכנות והבינוני חילופיים בתא העליון.
הערה: נסיגת סרום זה לאחר confluency מובילה להיווצרות שלפוטנציאל הממברנה גבוה. - לשאוב בינוני מתא מסנן, להעביר מוכן היטב ולמלא עם 500 בינוני μl. חזור על פעולה זו פעם. שים את תאי לילה לתוך החממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
4. מדידה של ההתנגדות החשמלית Transepithelial (TEER)
- לטבול טיפים אלקטרודה של voltohmmeter רקמות אפיתל במשך 15 דקות באתנול 80%. העבר voltohmmeter מתחת למכסה המנוע ולתת להתייבש אלקטרודה לרגע. מניח אלקטרודה לתוך מדיום תרבות בהתאמה המשמש את התאים במשך 15 דקות אחרות כדי לאזן.
- לבצע מדידות על ידי מיצוב הזרוע הארוכה של האלקטרודה כך שהוא נוגע בתחתית המגירה התחתונה בכל פעם, במקום זרוע הקצר לתוך תא הכנס המסנן.
הערה: ערכי התנגדות של מוסיף מסנן תרבית תאים ללא תאים בינוניים אמורה לשמש ערכי ריק כמו ((ערך נמדד (Ω) - ערך ריק (Ω)) x מסנןמשטח (כלומר 0.33 סמ"ר)). - אחרי בדיקת המקום האלקטרודה בחזרה לתוך אתנול 80% במשך 15 דקות. אחסן בתוך שפופרת יבשה.
5. קביעת חדירות Paracellular
- ממיסים 1 גרם FITC-אינולין ב 200 מ"ל בינוני תרבות בתוספת 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין 1% FCS. החל 50 מיקרוגרם / מ"ל של הפתרון לתוך תא מסנן העליון לפני ההדבקה של תאים.
- לאחר ההדבקה לאסוף דגימות בינוניות מהבאר הנמוכה כדי לקבוע כמה אינולין עבר מתא המסנן דרך שכבת התאים.
- כן פתרון סטנדרטי FITC-אינולין ולבצע 1: 2 דילולים, 10 פעמים (100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.13%, 1.56%, 0.78%, 0.39%, 0.2% ו 0%) . לקבוע קרינה על ידי מדידת כל דגימות קורא microplate.
6. הכנת חיידקים עבור זיהום של תאי HIBCPP על הוספת מסנן תרבית תאים
- יום אחד לפני הניסוי, לגרד tהוא נ קפוא meningitidis זנים מחוץ מניה-גליצרול פס על אגר שוקולד עם Vitox. לגדול לילה בחממה, על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2.
- חלץ 20-30 מושבות מתרבות לילה ולהעביר לתוך שפופרת המכילה 8 מ"ל Proteose Peptone בינוני בתוספת 0.042% 3 NaHCO, 0.01 M MgCl 2 ו -1% Polyvitex.
- לנער את החיידקים עבור 1.25 שעות ב 220 סל"ד, 37 ° C. גלולה חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 2684 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant ו resuspend גלולה חיידקי עם 8 מ"ל סרום ללא בינוני. וורטקס כדי להבטיח השעיה אפילו.
- כדי לקבוע צפיפות תרבות, למדוד דילול של 1:10 ב צפיפות אופטית (OD) של 600 ננומטר. התאם את השעית החיידקים כדי OD 600 של 0.1.
הערה: השעיה זו מכילה כ. 1 x 10 8 CFU / ml. - כדי לאשר את ריכוז תא החיידק, לדלל את בשלבי ההשעיה (1:10) עדדילול של 10 -5 צלחת לצלחות אגר שוקולד.
הערה: דילולים סדרתי דומה צריך להתבצע לחשב עקומות התפתחות חיידקים.
7. זיהום של תאי HIBCPP על הוספת מסנן תרבית תאים ו קביעת פלישת חיידקים ידי Immunofluorescence הזוגי
- לאחר שתמשיך תרבית תאים במדיום המכיל FCS 1% ואינסולין 5 מיקרוגרם / מ"ל, למדוד תאים מדי יום באמצעות voltohmmeter רקמת האפיתל. אם התאים הגיעו TEER של כ -500 Ω x cm², לבצע את הזיהום.
- להדביק את התאים עם השעית החיידקים המוכנה על ריבוי של זיהום (משרד פנים) של 10. חנות התאים הנגועים בחממה, על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 לתקופה המצוינת של זמן.
הערה: משרד הפנים יכול להיות מחושב על ידי לקיחה בחשבון את מספר תאים לכל כנס מסנן תרבית תאים בנקודת המפגש (1.21 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר). - עצור את להדביקיון על ידי שטיפה שלוש פעמים עם 500 μl בינוני סרום ללא (SFM) המכיל אלבומין 1% שור (BSA) להחיל את תא מסנן, 1 מ"ל ל המגירה התחתונה.
- חסום עם 500 SFM μl המכיל 1% חיץ BSA בתא לסנן 1 מ"ל בתא התחתון במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי למנוע הדבקות של נוגדנים אתרי הקישור נוקבים.
- דגירה עם 100 נ העיקרי μl נוגדן אנטי meningtidis α-OMP (1: 200) בתא לסנן 500 μl בתא התחתון במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: אם נדרש, ריכוז הנוגדן צריך להיות טיטרציה. - שוטפים את התאים על ידי aspirating המדיום מתא מסנן, להעביר את הכנס כדי לסנן SFM מוכן היטב עם 1 מ"ל המכיל BSA 1% ולמלא את תא מסנן רוקנו עם 500 μl SFM המכיל 1% BSA. חזור על פעולה זו פעמיים.
- תקן תאים עם 500 μl פורמלדהיד 4% compa מסנןrtment, 1 מ"ל בתא התחתון במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- שוטפים את התאים על ידי aspirating המדיום מתא מסנן, להעביר את הכנס כדי לסנן PBS מוכן היטב עם 1 מ"ל ולמלא את תא מסנן רוקנו עם 500 μl PBS. חזור על פעולה זו פעם.
הערה: דוגמאות ניתן לאחסן לילה PBS ב 4 ° C. - תרבות Cut תא קבוע מסננת של מוסיף ולשטוף עם 250 μl PBS המכיל 1% BSA. דגירה תאים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר עם 250 μl ניאון שכותרתו (עירור גל 594 ננומטר) משני נוגדנים עוף ארנב נגד (1: 500) להכתים חיידקים תאיים.
הערה: אם נדרש, ריכוז הנוגדן צריך להיות טיטרציה. - Permeabilize תאים עם 250 μl PBS המכיל BSA 1% ו -0.5% Triton X-100 עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. שטפו תאים שלוש פעמים עם 250 μl PBS המכיל 1% BSA.
- דגירה עם 250 נ העיקרי μl נוגדן אנטי meningitidis
- החל 250 μl של ניאון שכותרתו (גל עירור 488 ננומטר) נוגדנים משני (1: 500), שכותרתו ניאון (גל עירור 660 ננומטר) Phalloidin (1: 250) ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) ( 1: 50,000) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר להכתים חיידקי חוּץ ו תאיים, cytoskeleton יקטין וגרעינים.
הערה: אם נדרש, ריכוז הנוגדן צריך להיות טיטרציה. - שטפו תאים שלוש פעמים עם 250 μl PBS המכיל 1% BSA. שבץ תאי הרכבה בינוני ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד בדיקה באמצעות מיקרוסקופ.
- לקבוע מספר החיידקים פלשו לכל שדה מוגדר מראש. האם זה על ידי ספירת 20 שדות לכל קרום מסנן. חישוב אחוזי חיידקים פלשו.
הערה: הכפל את ספירת חיידקי ממוצע של 20 שדות מיקרוסקופיים עם שטח קואפיקient. התוצאה מבטאת את כמות החיידקים הכולל נוכח להכניס מסנן תרבית תאים 0.33 סמ"ר. מחלקי ערך זה על ידי כמות החיידקים גדלו בתקשורת במהלך תקופת ההדבקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מתארים culturing וזיהום של תאי HIBCPP במערכת להכניס תרבית תאים הפוכה. מודל זה מאפשר לנו לחקור מנגנוני פלישה ואת מסלולי איתות מולקולרית שבבסיס מצד התא basolateral, להתרבות מצב פיסיולוגי של חיידקים בהפצה והזנת תאי אפיתל דרך זרם הדם (איור 1).
תאי HIBCPP להציג פונקציות מחסום מסוימות, אשר מאפשרות להם להגביל חליפין מולקולריים לרמה מינימאלית. זו מושגת על ידי הביטוי של צומת adherens (AJ) וצומת חזקה (TJ) חלבונים. ניתוח Immunofluorescence של החלבונים הקשורים TJ Occludin, Claudin ו ZO-1 חשף אות רצופה באתרי מגע תאי תאים, הוכחה כי התאים הם מחוברים על ידי קווצות רציפות של TJS (איור 2 א, ב, ג). רושם מפורט של tהוא TJ המורפולוגיה התקבלה על ידי שידור (איור 2 ד) ולהקפיא במיקרוסקופ אלקטרונים שברים (איור 2E), אשר מראה כי TJS ממוקם בין התאים ויוצרים רחבים, מבני כבל דמוי מרושתים.
TJS של תאי אפיתל גם לפעול כגדר להפריד תחומים קרום apical ו basolateral, ולכן תורם קוטביות הסלולר. בין חלבונים, אשר באים לידי ביטוי אך ורק בצד התא basolateral של תאים HIBCPP, הם חלבון AJ E-cadherin (Ecad) ואת הקולטן לגורם הצמיחה hepatocyte (HGF / Met) כפי שמוצג על ידי ניתוח immunofluorescence באיור 3, מצביע על רמת קוטביות מסוימת.
כאשר בתרבית בתנאים מתאימים תאי HIBCPP גם תערוכת פונקציות מחסום טיפוסיות של BCSFB כמו היווצרות של פוטנציאל הממברנה וכן חדירות נמוכה עבור macromolecules. קביעת פוטנציאל הממברנה יכולה להיות מושגת על ידי מדידת TEER עם השימוש של voltohmmeter. החדירות של שכבת התאים היא לכמת ידי יישום של FITC שכותרתו אינולין, סוכר שעובר השכבה בצורה paracellular. כאן, אנו מציגים תוצאות של ניסוי נציג אשר מביא לידי ביטוי שמתפקד מחסום אלה להישאר יציבה מראה חיבה מריכוזי רמת sulfoxide דימתיל (DMSO), ממס משותף כימיקלי מגרת תא. כפי שניתן לראות בתרשים 4A, ערכי TEER נרשמו לפני ואחרי החשיפה של תאי HIBCPP כדי DMSO.
התאים מוצגים פוטנציאל הממברנה גבוה שהגיע עד כ -500 Ω x סמ"ר בתחילת הניסוי עבור כל התנאים. הנמדד TEER לא השתנה גם לאחר 2 שעות עבור תאים שטופלו עד 0.2 כרך% DMSO. לעומת זאת, ערכי TEER ירדו בתוך ש"ש באופן תלוי מינוןen בכמויות גבוהות יותר יושמו (איור 4 א). הפחתה זו פוטנציאל הממברנה הייתה במקביל עם חדירות מוגברות מקרומולקולות. בעוד תוספת של DMSO לתאי HIBCPP עד 0.5% בנפח לא לגרום לעלייה חדירה עבור אינולין, 1% בנפח ו -2% בנפח מוצגים השפעה, אם כי במידה מוגבלת (האיור 4B). יתר על כן, בדקנו את השפעת Cytochalasin D, מעכב חזק של פילמור אקטין, על פוטנציאל הממברנה וחדירות של תאים HIBCPP. טיפול של התאים עם Cytochalasin D 1 מיקרוגרם / מ"ל גורם לירידה משמעותית של ערכי TEER וכן מגידול השטף FITC-אינולין (איור 4 א, ב). השפעה זו יכולה להיות מוסברת על ידי פתיחת TJS שנגרם Cytochalasin ד
שורת תא HIBCPP כמודל של BCSFB יכולה להיות מועסקת על מנת לחקור אינטראקציות של פתוגנים לתאי האפיתל יוצרי המכשול. יש ראיותכי נ החיידק meningitidis רווח כניסת CNS ידי חציית BCSFB. הוכח כי Neisseria לפלוש תאי HIBCPP במיוחד מצד התא basolateral, אשר רלוונטי in vivo. במהלך תהליך זה הקפסולה החיידקים ממלאים תפקיד חשוב: מוטנטים חסרי-Capsule להראות גדל פלישה לתאי HIBCPP 5. בחודש הבא השווינו פלישת basolateral של זן MC58 17, מוטצית isogenic שלה MC58siaD - לקויה לייצור קפסולה 17 לבין מוביל unencapsulated לבודד α14 19,20. תאי HIBCPP נדבקו הזנים הנ"ל על מהלך זמן של 4 שעות ב משרד פנים של 10. ניתוח Immunofluorescence חשף פלישה משמעותית עבור שני זני פתוגניים MC58 ו- MC58siaD -, ואילו שיעורי פלישה קלים בלבד נצפו עבור זן α14 apathogenic ( איור 5 א). תמונה מייצגת של immunoflu הכפולמיקרוסקופיה orescence של תאי HIBCPP נגועים זן בהתאמה מוצגת באיור 5A, B ו- C.
איור 1:. סטנדרד אנד הפוך Cell תרבות מערכת במערכת תרבית תאים הסטנדרטית (A, C) אינטראקציה של חיידקים עם לתאי האפיתל CP יכולה להיחקר בצד תא הפסגה, אשר מסומן על ידי microvilli. מערכת תרבית תאים הפוכה (B, D) מאפשרת לנו לחקור את האינטראקציה חיידקי עם קרום התא basolateral, אשר מעורב במהלך הפלישה חיידקי באמצעות זרם הדם אל מערכת העצבים המרכזית. עבור תרבית תאים ההפוכה (E) תאי HIBCPP הם זורעים על הצד התחתון של מוסיף המסנן. הבאר התחתונה כוללות התא הפנימי של כנס המסנן מוצף בינוני. Subsequently, המדיום המוגזם הוא aspirated בצורה כזאת כי התא הפנימי של להכניס את המסנן נשאר מלאה. ביום הראשון לאחר זריעה, מוסיף מסנן תרבית תאים הם התהפכו מלאים בינוניים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. תאי HIBCPP הצגה קווצות רציפות של TJS TJ חלבוני ZO-1 (א), Occludin (ב ') Claudin-1 (C) התגלו תאי HIBCPP. לוחות AC להראות תמונות Apotome. מרכז של כל פאנל: xy אן-פאס לאור התאים; בצד עליון ימני: סעיפים צולבים של פרוסות אופטיות כמה דרך z -plane. ברי סולם עולים 10 מיקרומטר. מבנה TJ של תאי HIBCPP נותח על ידי transmisבמיקרוסקופ אלקטרוני שיאון. תאים מחוברים ביניהם על ידי TJS, אשר מסומנים על ידי חצים (D). סרגל הסולם עולה 1 מיקרומטר. להקפיא מחקרים במיקרוסקופ אלקטרונים שברים לדמיין מקרוב מרושתים גדילי TJ (E). הבר בקנה המידה = 0.5 מיקרומטר. התמונות בנתון זה פורסמו במקור Schwerk ואח, PLoS ONE 7: e30069, doi:. 10.1371 / journal.pone.0030069 (2012); מחדש הדפסה באישורו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ביטוי של חלבונים קולטן מעורב במהלך הפלישה של חיידקים תאים HIBCPP ביטוי מציג ניתוח Immunofluorescence של Ecad (א) ו Met (B) בצד התא basolateral.. pictures להציג תמונות Apotome. מרכז של כל פאנל: xy אן-פאס לאור התאים; בצד עליון ימני: חתך של פרוסות אופטיות כמה דרך -plane z. קרום apical של תאים HIBCPP (מסומנת בחצים) ממוקם לכיוון החלק העליון של החלק העליון, כמו גם לכיוון ימין של הצד הימני, בהתאמה, של כל מסגרת. ברי סולם = 10 מיקרומטר. הנתונים בנתון זה גם פורסמו בעבר Gründler ואח, חיידקים להדביק 15: 291-301, doi:.. 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); מחדש הדפסה באישורו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: השפעת DMSO ו Cytochalasin D על תפקוד המחסום של תאים HIBCPP השפעות על func המכשול.tion נקבע על ידי מדידת ערכי TEER ו FITC-אינולין-Flux. תוצאות מוצגות בניסוי אחד מייצג, אשר בוצע ב triplicates. תאי HIBCPP טופלו DMSO וכן Cytochlalasin D בסכומים המותווים 2 hr. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כאשר מוחל בריכוזים עד 0.2% בנפח, DMSO אינו משפיע פוטנציאל הממברנה (איור 4 א). בריכוזים הנעים בין 0.1% כרך עד 0.5 כרך% של DMSO גם לא משפיעים חדירות paracellular של התאים (איור 4). לעומת זאת, 1 מיקרוגרם / מ"ל Cytochalasin D גורם לירידה מקבילה TEER עם עלייה FITC-אינולין-Flux דרך שכבת התאים (איור 4 א, ב).
איור 5: פלישה של נ meningitidis לתאי HIBCPP. מופעי מיקרוסקופיה immunofluorescence הזוגי פלש (ירוק) ודבקו חיידקים (צהובים). קופסות לבנות בתוך תמונות לייצג את פירוט תמונה המוגדלת בצד ימין. פלישת basolateral נצפתה עבור נ meningitidis זני MC58 (א) ו MC58siaD -, חסר לייצור קפסולה (B), ואילו שיעור פלישה קל בלבד נקבע α14 (C). התרשים מדגים כי שיעורי הפלישה MC58 ו- MC58siaD - הם משמעותיים מאוד בהשוואה α14 (**, p <0.01). משמעות אקסטרים מוצג כאשר MC58 או MC58siaD -, בהתאמה, הושוו α14 (***, p <0.001) ו MC58siaD - הושווה MC58 (###, p <0.001). סולם bars אינדיקהטה 10 מיקרומטר. . התרשים בר פורסם במקור Borkowski ואח, J neuroinflammation 11: 163, doi: 10.1186 / s12974-014-0163-x (2014); מחדש הדפסה באישורו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לתאי האפיתל של CP מהווים את BCSFB שמפריד בין CSF מן 2,3 דם. לאחרונה הקים את הקו הסלולרי HIBCPP כמודל אנושי מתפקד של BCSFB. התאים להציג פונקציות מחסום חשובות של BCSFB במבחנה, כוללים הפיתוח של פוטנציאל הממברנה גבוה, חדירות נמוכות עבור מקרומולקולות, כמו גם הנוכחות של גדילים רציפים של TJS 5. חלבוני TJ לתרום קוטביות פסגה / basolateral של התאים. הקוטביות היא בעלת חשיבות גבוהה עבור לוקליזציה בבימויו של הקולטנים כמו גם חלבונים טרנספורטר ספציפיים. הראינו לוקליזציה הקוטב של קולטנים Ecad ונפגש וכן חברי קלטת ATP מחייב (ABC) המשפחה טרנספורטר השומרת על המיקרו-סביבה מבוקרת מאוד בתוך מערכת העצבים המרכזית 6,7.
ישנן מספר מיקרואורגניזמים המסוגלים להיכנס אל מערכת העצבים המרכזית על ידי להתגבר על BCSFB, leadinגרם למחלות קשות כולל דלקת קרום המוח 8. אחד פתוגנים מסוגלים פולש לתאי אפיתל CP הוא נ החיידק ספציפי-אדם גראם שלילי 9,10 meningitidis, אשר הוכח לחדור לתאי HIBCPP באופן קוטבי במיוחד מצד התא basolateral 5. זהו הכיוון רלוונטי מבחינה פיזיולוגית עבור זיהום של המוח ברחבי BCSFB כאשר חיידקים להפיץ ותאי אפיתל המפגש CP מהדם במהלך דלקת קרום המוח. כדי לשקף את המצב במבחנה, תאי HIBCPP גדלים בצד התחתון של המסנן. בניגוד למודל כנס מסנן הסטנדרטי, שבו תאים הם זורעים לתוך התא העליון, עד קבוצה זו של מערכת תרבות הפוכה מאפשר להדביק תאי אפיתל במיוחד מצד התא basolateral 5,21.
פלישת basolateral לתאי HIBCPP נצפתה במשך שני נ פתוגניים meningitidis -, ואילו ההספק שאינו פתוגניים לבודד α14 מוצג פלישה שולית בלבד 15. זה ממחיש כי המודל הסלולרי HIBCPP מספק את האפשרות לסרוק ספריות מוטציה זמינות עבור גורמים ארסיים רומן המעורב במהלך תהליך הפלישה. ראוי לציון, הודגם כי פתוגנים אחרים כולל L. חיידקי סטרפטוקוקוס suis (suis ס) לפלוש תאי HIBCPP באופן קוטבי 5,7.
כדי לזהות ולהגיב פולשים מיקרואורגניזמים לתוך מערכת העצבים המרכזית, לתאי האפיתל של CP להביע PRRs 22,23. TLRs לייצג משפחה חשובה בתוך PRRs. איכותי RT-PCR ניתוחים הראו כי תאים HIBCPP להביע כמה TLRs וכן שיתוף קולטנים קשורים המולקולה מתאם MyD88 15. זה נצפה כי קולטני TLR2 ו TLR4 מעורב תגובת גינת הסלולר נ meningסוכרי קופסית itidis 24. תוצאות נוספות של גישת microarray גילו כי תאי HIBCPP נגועים נ meningitidis להציג אינדוקציה של מסלולי העברת אותות, בקרב גורמים אחרים גם לערב את הרגולטור תעתיק IκBζ 15, חובה עבור הביטוי של גנים מסוימים היעד כולל il6 25,26, ציטוקין פרו-דלקתיים.
כדי לאשר את הממצאים הללו, תאי HIBCPP נגועים נ meningitidis במערכת תרבות הפוכה שמש לחקור את שחרורו של ציטוקינים chemokines. זה ידוע כי תהליך זה נועד להסית תגובה דלקתית על ידי הפעלה של 13,14 מערכת החיסון המולדת. תאי HIBCPP מייצרים ומפרישים ציטוקינים chemokines, כולל CXCL1-3, IL6, IL8 ו TNFα 15,16, אשר תוארו למשוך נויטרופילים ומונוציטים 27. על ידי העסקת לנו מערכת המודל שלנונמצא כי נויטרופילים polymorphnuclear, מונוציטים וגם לימפוציטים מסוג T נודדים תאי HIBCPP 16,28, והדגיש כי תאים HIBCPP מתאימים פענוח מנגנונים של הגירה transepithelial של תאי מערכת החיסון.
מערכת המודל המוצג לעיל גם מציעה הזדמנות שינויים. תאי HIBCPP ניתן pretreated עם נוגדנים או מעכבים כימיים לזהות קולטנים לאותת מסלולי העברה מעורבים במהלך הדבקה. DMSO, ממיס נפוץ ריאגנטים מגרה תא ניתן ליישם בכמויות המתאימות לתאי HIBCPP, אשר להציג פונקציות מחסום יציב שאינם מושפעים על ידי כימיים לאורך הקורס הזמן לחקור. מאפיין זה הוא רלוונטי גם עבור שימוש במודל במחקרי תרופות.
אמנם יש לנו הראינו כי תאי HIBCPP להראות רמה מסוימת של קוטביות, הם לא משקפים באופן טבעי בכל פרט ופרט של מודל vivo. <em> לדוגמא הלוקליזציה של בני מש' טרנספורטר ABC באופן חלקי בלבד תואם לדפוסים הצפויים 6, למה יישומי תרופות כנראה יכולים להיות מיושמים רק במידה מוגבלת. כמו כן, תאי HIBCPP לא נראים לייצר CSF (מידע לא מוצג). אף על פי כן, מצאנו כי תאים HIBCPP להביע את החלבונים Transthyretin, גורם גדילה דמוי אינסולין 2 (IGF2) ו forkhead תיבת J1 (FOXJ1) על RNA רמה 5, אשר הם חלבונים סמן אופייני לתאי האפיתל CP 29,30,31,32 . תצפית זו תומכת שתאי HIBCPP שומרים מאפיינים טיפוסיים של תאי אפיתל CP. חשוב לציין, יש לציין כי תאי HIBCPP אינם מציג עיכוב קשר. לכן חיוני כדי להשתמש בתאים לניסויים כאשר ערכי TEER מתאימים הם הגיעו. יתר על כן, תאי HIBCPP לא אמורים לשמש מעבר מעבר 38, מאז הפוטנציאל לפתח תפקוד מחסום כמו צונח עם קטעים גבוהים. לבסוף, כדי ללמוד את השדוןמעשה תאי תאי אינטראקציות במהלך הזיהומים בבית BCSFB מודל שיתוף תרבות המורכבים של אפיתל CP ו האנדותל יהיה עניין גבוה, אבל מודל כזה עדיין צריך להתפתח.
לסיכום, מודל תרבית תאי HIBCPP ניתן להשתמש כדי לחשוף נתיבי פלישת מפתח מסלולי העברת אותות בסיסיים, במיוחד של פתוגנים אנושיים ספציפית בבית BCSFB. כידוע כי לתאי האפיתל של CP מעורבים גם בהפרעות ניווניות נוירולוגיות כולל מחלת אלצהיימר, כמו גם טרשת נפוצה 2, וגם גרורות במוח של תאים סרטניים 33, המערכת מציעה בכלל מגוון גדול של הזדמנויות לחקירה של מנגנונים הקשורים למחלות, מתן הפוטנציאל למצוא מטרות טיפוליות חדשניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
