मानव रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा का एक रंजित जाल उपकला सेल आधारित मॉडल basolateral साइड से जीवाणु संक्रमण का अध्ययन करने के लिए
Summary
The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
Abstract
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
Introduction
रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा (BCSFB) रक्त और मस्तिष्क 1 के बीच तीन बाधा साइटों में से एक है। इसके रूपात्मक सहसंबंधी रंजित जाल (सीपी) 2,3 के उपकला कोशिकाओं रहे हैं, एक endothelial उपकला convolute, जो दृढ़ता से vascularized और मस्तिष्क के निलय में स्थित है। सीपी मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) के उत्पादन के साथ ही रक्त से उत्तरार्द्ध को अलग करने के लिए कार्य करता है। आदेश में बाधा समारोह को प्राप्त करने के लिए, सीपी उपकला कोशिकाओं, एक कम pinocytotic सक्रियता दिखाई विशिष्ट ट्रांसपोर्टरों एक्सप्रेस, और घनी तंग जंक्शनों (TJS) 2,3 की एक सतत नेटवर्क से जुड़े हुए हैं।
मानव पैपिलोमा रंजित जाल (HIBCPP) कोशिकाओं, एक जापानी महिला 4 के एक घातक रंजित जाल पैपिलोमा से निकाली गई, BCSFB के इन विट्रो मॉडल में एक कार्यात्मक निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। HIBCPP कोशिकाओं टी जे के गठन के रूप में एक कार्यात्मक BCSFB की विशेषताओं में से एक जोड़े को दिखानेकिस्में, एक उच्च transepithelial झिल्ली क्षमता है कि transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) के रूप में निर्धारित किया जा सकता का विकास, और बड़े अणुओं के लिए नाबालिग permeabilities। इसके अलावा, HIBCPP कोशिकाओं विशेषता ट्रांसपोर्टरों, जो आयनिक microenvironment विनियमित करने के लिए सेवा कर सकते हैं, और शिखर / basolateral polarity 5,6,7 दिखाने व्यक्त करते हैं।
BCSFB केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 8 में लिए रोगजनकों (बैक्टीरिया, वायरस, और कवक) एक प्रवेश स्थल के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया है। नेइसेरिया meningitidis (एन मेनिन्जाइटिडिस), एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु, सहित रोगजनकों, दिमागी बुखार के आक्रमण की तरह गंभीर रोगों का कारण बन सकता है। सबूत है कि यह सी.पी. की सुरक्षात्मक उपकला बाधा पर काबू पा मेनिंगोकोक्सल रोग वाहिकाओं और सी.पी. उपकला कोशिकाओं 9,10 में meningococci की मात्रा में वृद्धि का प्रदर्शन के साथ रोगियों में histopathological टिप्पणियों के द्वारा समर्थित है। मेजबान कोशिकाओं बीए में प्रवेश पाने के लिएcteria अक्सर endocytotic तंत्र है, जो मध्यस्थता या विशिष्ट सतह मेजबान कोशिकाओं पर स्थित रिसेप्टर्स से शुरू हो रहे अपहरण। चूंकि इन रिसेप्टर्स के साथ रोगाणुओं की बातचीत प्रजातियों हो सकता है विशेष 11, पशु मॉडल केवल एक सीमित हद तक विचार-विमर्श किया जा सकता है। HIBCPP सेल लाइन आक्रमण प्रक्रिया के साथ ही एक मानव मॉडल प्रणाली में अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। सेल संस्कृति सम्मिलित रोजगार हमें दो अलग सेल पक्षों से मेजबान कोशिकाओं के साथ रोगाणुओं की बातचीत का विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है। कई बैक्टीरिया, एन सहित मेनिन्जाइटिडिस, दृढ़ता से संक्रमण assays के दौरान गुरुत्वाकर्षण के प्रभाव के अधीन हैं। assays के दौरान HIBCPP कोशिकाओं के साथ रोगाणुओं की इष्टतम बातचीत के लिए, बैक्टीरिया शुरू में सेल संस्कृति फिल्टर डालने प्रणाली के ऊपरी डिब्बे में जुड़ जाते हैं। शिखर या basolateral सेल की ओर, एस्टा क्रमश: इन विट्रो प्रणाली के दो रूपों गया है से संक्रमण सक्षम करने के लिएblished: मानक प्रणाली में HIBCPP कोशिकाओं फिल्टर डालने के ऊपरी डिब्बे में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, स्थिति नकल उतार जब सूक्ष्मजीवों सीएसएफ साइड पर स्थित है और कोशिकाओं (चित्रा 1 ए, सी) के शिखर पक्ष के साथ संपर्क में प्राप्त कर रहे हैं। इसके विपरीत, एक औंधा सेल संस्कृति फिल्टर डालने सिस्टम में HIBCPP कोशिकाओं का उपयोग की स्थिति जब बैक्टीरिया रक्त प्रवाह में प्रवेश किया है दर्शाता है। सूक्ष्मजीवों रक्त और मुठभेड़ सी.पी. basolateral पक्ष (चित्रा 1 बी, डी) से उपकला कोशिकाओं में प्रसार। उल्लेखनीय है, इस मॉडल प्रणाली में यह दिखाया गया है कि बैक्टीरिया basolateral सेल की ओर 5.7 से विशेष रूप से एक ध्रुवीय फैशन में HIBCPP कोशिकाओं पर आक्रमण।
इसके बाद सीपी के संक्रमण के लिए, पर आक्रमण रोगजनकों सहज प्रतिरक्षा पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स करने के लिए बंधाव के माध्यम से व्यवस्था (PRRS) द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है। PRRS की अच्छी तरह से वर्णित सदस्यों टोल की तरह रिसेप्टर (TLR) परिवार के हैं। TLRs कर सकते हैं बिनसंक्रामक सूक्ष्मजीवों की विशेषता संरचनाओं, जो करार दिया रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) कर रहे हैं करने के लिए डी। रिसेप्टर्स की बंधाव मेजबान सेल की सक्रियता के cascades संकेत है कि साइटोकिन्स और chemokines 12 है, जो बारी में BCSFB 13,14 भर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानांतरगमन को प्रोत्साहित की अभिव्यक्ति को गति प्रदान करने के लिए ले जाता है। यह दिखाया गया है कि HIBCPP कोशिकाओं mRNA स्तर पर कई TLRs और एन के साथ कि संक्रमण का इजहार मेनिन्जाइटिडिस कई साइटोकिन्स और chemokines, CXCL1-3, IL6, IL8 और TNFα 15,16 सहित के स्राव में यह परिणाम है।
यहाँ, हम एक औंधा सेल संस्कृति डालने प्रणाली है कि BCSFB mimics में खेती और मानव कोशिका लाइन HIBCPP के संक्रमण का वर्णन है। इस मॉडल प्रणाली में विवो प्रासंगिक basolateral सेल पक्ष के रूप में अच्छी तरह से बाद में सेलुलर प्रतिक्रिया के साथ रोगाणुओं की बातचीत का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीपी की उपकला कोशिकाओं BCSFB कि रक्त 2,3 से सीएसएफ को अलग रूप में। हमने हाल ही में BCSFB के एक कार्यात्मक मानव मॉडल के रूप में HIBCPP सेल लाइन की स्थापना की। कोशिकाओं इन विट्रो में BCSFB के महत्वपूर्ण बाधा काम कर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
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