The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
A barreira de fluido cerebrospinal de sangue (BCSFB) é um dos três locais de barreira entre o sangue e o cérebro um. Seu correlato morfológicas são as células epiteliais do plexo coróide (CP) de 2,3, um convoluta-endotelial epitelial, que é fortemente vascularizado e localizado nos ventrículos do cérebro. A CP serve para produzir o fluido cerebrospinal (CSF), bem como para separar o último do sangue. A fim de conseguir a função de barreira, as células epiteliais CP mostram uma actividade pinocitótica baixo, expressar transportadores específicos, e estão densamente ligadas por uma rede contínua de junções apertadas (TJS) 2,3.
Células do plexo coróide do papiloma humano (HIBCPP), derivados a partir de um plexo coróide do papiloma maligno de uma japonesa 4, foram utilizados para construir um modelo funcional em vitro da BCSFB. HIBCPP células mostram um par de características de um BCSFB funcional, tal como a formação de TJfios, o desenvolvimento de um potencial de membrana transepitelial alta que pode ser determinado como a resistência eléctrica transepitelial (TEER), e permeabilidades menores para macromoléculas. Além disso, as células HIBCPP expressar transportadores característicos, que podem servir para regular o micro ambiente iónico, e mostram apical / basolateral 5,6,7 polaridade.
O BCSFB foi mostrado funcionar como um local de entrada para agentes patogénicos (bactérias, vírus, e fungos) no sistema nervoso central (SNC) 8. A invasão de agentes patogénicos, incluindo Neisseria meningitidis (N. meningitidis), uma bactéria Gram-negativa, podem causar doenças graves, como a meningite. A prova de que ele ultrapassa a barreira epitelial de protecção do CP é suportado por observações histopatológicas em pacientes com doença meningocócica exibindo aumento da quantidade de meningococos nos vasos e as células epiteliais 9,10 CP. Para ganhar a entrada em células hospedeiras bacteria muitas vezes mecanismos de endocitose sequestrar, que são mediados ou desencadeada pelos receptores de superfície específicos localizados nas células hospedeiras. Uma vez que as interacções dos agentes patogénicos com estes receptores pode ser espécies modelos 11, específicos dos animais só pode ser consultado em medida restrita. A linha celular HIBCPP proporciona a oportunidade de estudar o processo de invasão, bem como os mecanismos moleculares subjacentes em um sistema modelo humano. Empregando inserções de cultura de células nos permite analisar as interacções dos agentes patogénicos com células hospedeiras de dois lados celulares distintas. Muitas bactérias, incluindo N. meningitidis, são fortemente sujeito ao impacto da gravidade durante ensaios de infecção. Para optimizar a interacção dos agentes patogénicos com as células HIBCPP durante os ensaios, as bactérias são inicialmente adicionado para dentro do compartimento superior do sistema de cartucho filtrante de cultura de células. Para permitir que a infecção do lado apical ou do lado basolateral da célula, respectivamente, duas variações do sistema in vitro têm sido ESTAestabe-: No sistema standard HIBCPP células são semeadas para dentro do compartimento superior do elemento filtrante, simulando a situação quando os microrganismos estão localizados no lado-CSF a e entrar em contacto com o lado apical das células (Figura 1 A, C). Em contraste, usando as células HIBCPP num sistema de inserção de cultura de células de filtro invertido reflecte as condições quando as bactérias tenham entrado no fluxo sanguíneo. Microorganismos difundir no sangue e encontro CP células epiteliais do lado basolateral (Figura 1B e D). Digno de nota, neste sistema modelo, foi demonstrado que as bactérias invadem as células HIBCPP numa forma polar especificamente de 5,7 lado basolateral da célula.
Subsequentemente à infecção do CP, os agentes patogénicos podem ser invadidos reconhecido pelo sistema imune inato através de ligação a receptores de reconhecimento de padrões (SRRS). membros bem descritas de PRRS pertencem à família dos receptores de tipo Toll (TLR). pode TLRs bind para estruturas características de microorganismos infecciosos, que são padrões moleculares associados a agentes patogénicos denominado (PAMPs). A ligação dos receptores leva à activação da célula hospedeira cascatas de sinalização que provocam a expressão de citocinas e quimiocinas 12, que por sua vez estimulam a transmigração de células imunes em todo o BCSFB 13,14. Tem sido demonstrado que as células HIBCPP expressar vários TLRs ao nível do mRNA e que a infecção com N. meningitidis resulta na secreção de várias citocinas e quimiocinas, incluindo CXCL1-3, IL6, IL8 e TNFa 15,16.
Aqui, nós descrevemos o cultivo e infecção da linha celular humana HIBCPP num sistema de inserção de cultura de célula invertido que imita o BCSFB. Este sistema modelo permite estudar as interacções dos agentes patogénicos com o lado da célula in vivo, relevante basolateral, bem como a subsequente resposta celular.
As células epiteliais do CP formar o BCSFB que separa o CSF a partir do sangue 2,3. Recentemente, estabeleceu a linha de células HIBCPP como um modelo humano funcional do BCSFB. As células apresentam funções de barreira importantes da BCSFB in vitro, incluindo o desenvolvimento de um potencial de membrana elevada, uma baixa permeabilidade de macromoléculas, bem como a presença de filamentos contínuos de TJs 5. As proteínas TJ contribuir para uma polaridade apical / basolateral das…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
Insulin | Sigma | 19278 | |
MgCl2 | Sigma | 2393 | |
NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
Proteose peptone | BD | 211684 | |
Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |