The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
Blod-cerebrospinalvätska barriär (BCSFB) är en av de tre spärrställen mellan blodet och hjärnan 1. Dess morfologiska korrelat är de epiteliala cellerna i koroidea plexus (CP) 2,3, en endotel-epitelial inklädning som är starkt vaskulariserad och ligger i hjärnans ventriklar. CP tjänar till att producera i cerebrospinalvätskan (CSF) samt för att separera den senare från blodet. För att uppnå barriärfunktion, de CP epitelceller visar en låg pinocytotic aktivitet, uttrycka specifika transportörer, och är tätt förbundna med ett kontinuerligt nätverk av tight junctions (TJs) 2,3.
Human choroid plexus papillom (HIBCPP) celler, härledda från en malign åderhinna plexus papillom av en japansk kvinna 4, användes för att konstruera en funktionell i modell av BCSFB vitro. HIBCPP celler visar ett par av egenskaper hos en funktionell BCSFB som bildandet av TJsträngar, utveckling av en hög transepitelial membranpotential som kan bestämmas som transepitelialt elektrisk resistans (TEER), och mindre permeabilitet för makromolekyler. Dessutom HIBCPP celler uttrycker karakteristiska transportörer, som kan användas för att reglera den joniska mikro och visa apikala / basolateral polaritet 5,6,7.
Den BCSFB har visat sig fungera som ett ingångsställe för patogener (bakterier, virus och svampar) i det centrala nervsystemet (CNS) 8. Invasionen av patogener, inklusive Neisseria meningitidis (N. meningitidis), en gramnegativ bakterie, kan orsaka allvarliga sjukdomar som hjärnhinneinflammation. Bevis för att det övervinner den skyddande epitelbarriär av CP stöds av histopatologiska observationer hos patienter med meningokocksjukdom uppvisar ökade mängder av meningokocker i kärlen och CP epitelceller 9,10. För att få inträde i värdceller bacteria kapa ofta endocytotisk mekanismer, vilka förmedlas eller utlöses av specifika ytreceptorer belägna på värdcellerna. Eftersom interaktioner av patogener med dessa receptorer kan vara artspecifika 11, djurmodeller endast kan konsulteras för att en begränsad utsträckning. Den HIBCPP cellinje ger möjlighet att studera invasionen processen samt de underliggande molekylära mekanismer i människans modellsystem. Utnyttjar cellodlingsinsatser ger oss möjlighet att analysera interaktioner mellan patogener med värdceller från två olika cell sidor. Många bakterier, inklusive N. meningitidis, är starkt omfattas av effekterna av tyngdkraften under infektionsanalyser. Optimal samverkan av patogener med de HIBCPP celler under analyserna, är bakterierna initialt läggs in i den övre avdelningen av cellodlingsfilterinsatsen system. För att möjliggöra infektion från den apikala eller basolaterala cellsidan, respektive, har två varianter av systemet in vitro varit established: I standardsystemet HIBCPP celler ympas in i den övre avdelningen av filterinsatsen, som imiterar den situation då mikroorganismer är belägna på CSF-sidan och komma i kontakt med den apikala sidan av cellerna (figur 1A, C). I motsats, med hjälp av HIBCPP celler i en inverterad cellodlingsfilterinsatsen system återspeglar de villkor när bakterier har kommit in i blodet. Mikroorganismer sprida i blodet och möter CP epitelceller från den basolaterala sidan (Figur 1B, D). Anmärkningsvärd, i detta modellsystem har det visat sig att bakterier invadera HIBCPP celler i ett polärt mode specifikt från den basolaterala cellsidan 5,7.
Därefter till infektion av CP kan invaderade patogener erkännas av det medfödda immunförsvaret genom ligering till mönsterigenkänningsreceptorer (PRRs). Väl beskrivna medlemmar av PRRS tillhör Toll-like receptor (TLR) familj. TLRs kan bind karakteristiska strukturer av smittsamma mikroorganismer, som kallas patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs). Ligering av receptorema leder till aktivering av värdcell signaleringskaskader som utlöser expression av cytokiner och kemokiner 12, vilka i sin tur stimulerar transmigration av immunceller tvärs över BCSFB 13,14. Det har visat sig att HIBCPP celler uttrycker flera TLRs på mRNA-nivå och att infektion med N. meningitidis resulterar i sekretion av flera cytokiner och kemokiner, inklusive CXCL1-3, IL6, IL8 och TNFa 15,16.
Här beskriver vi odling och infektion av den humana cellinjen HIBCPP i en inverterad cellodlingsinsats system som återspeglar BCSFB. Detta modellsystem gör det möjligt att studera interaktioner av patogener med in vivo-relevanta basolaterala cellsidan såväl som den efterföljande cellulära svaret.
Epitelcellerna i CP bilda BCSFB som separerar CSF från blodet 2,3. Vi etablerade nyligen HIBCPP cellinje som en funktionell mänsklig modell av BCSFB. Cellerna visa viktiga barriärfunktioner BCSFB in vitro, bland annat utveckling av en hög membranpotential, en låg permeabilitet för makromolekyler, liksom närvaron av kontinuerliga strängar av TJs 5. De TJ-proteinerna bidrar till en apikal / basolateral polaritet av cellerna. Polariteten är av stor betydelse för en riktad lokaliseri…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
Insulin | Sigma | 19278 | |
MgCl2 | Sigma | 2393 | |
NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
Proteose peptone | BD | 211684 | |
Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |