En årehinnen Plexus epithelial Cell-basert modell av Human Blood-cerebrospinalvæsken Barrier å studere bakteriell infeksjon fra basolaterale Side
Summary
The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
Abstract
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
Introduction
Blod-cerebrospinalvæske barriere (BCSFB) er en av de tre barriereseter mellom blod og hjerne 1. Dens morfologiske korrelat er de epitelceller i choroid plexus (CP) 2,3, en endotelial-epitelial sammenrullet, som er sterkt vaskularisert og som er plassert i ventriklene i hjernen. CP tjener til å frembringe i cerebrospinalvæsken (CSF), så vel som å skille sistnevnte fra blodet. For å oppnå barrierefunksjon, CP epitelceller viser en lav pinocytotic aktivitet, uttrykt spesifikke transportører, og er tett forbundet ved hjelp av et kontinuerlig nettverk av tett veikryss (TJs) 2,3.
Humant choroid plexus papilloma (HIBCPP) celler, avledet fra en ondartet choroid plexus papilloma fra et japansk kvinne 4, ble brukt til å konstruere et funksjonelt in vitro modell av BCSFB. HIBCPP celler viser et par av egenskapene til en funksjonell BCSFB som dannelsen av TJtråder, utvikling av en høy transepitelial membranpotensialet som kan bestemmes som transepitelial elektrisk motstand (teer), og mindre permeabiliteter for makromolekyler. Videre HIBCPP celler uttrykker karakteristiske transportører, som kan tjene til å regulere den ioniske mikromiljøet, og viser apikale / basolateral polaritet 5,6,7.
Den BCSFB har vist seg å fungere som en innføringsstedet for patogener (bakterier, virus og sopp) inn i sentralnervesystemet (CNS) 8. Invasjonen av patogener, inkludert Neisseria meningitidis (N. meningitidis), en Gram-negative bakterien, kan føre til alvorlige sykdommer som hjernehinnebetennelse. Bevis for at det overvinner den beskyttende epithelial barriere av CP er støttet av histopatologiske observasjoner hos pasienter med meningokokksykdom stiller økte mengder meningokokker i fartøyene og CP epitelceller 9,10. For å få innpass i vertsceller bacteria ofte kapre endocytotic mekanismer, som er mediert eller utløses av spesifikke overflatereseptorer plassert på vertsceller. Siden interaksjoner av patogener med disse reseptorene kan være artsspesifikt 11, dyremodeller kan bare bli konsultert i et begrenset omfang. Den HIBCPP cellelinje gir anledning til å studere invasjonsprosessen, så vel som de underliggende molekylære mekanismer i et menneske modellsystem. Ansette cellekultur inserts gjør oss i stand til å analysere interaksjoner av patogener med vertsceller fra to forskjellige celle sider. Mange bakterier, inkludert N. meningitidis, er sterkt utsatt for virkningen av tyngdekraften under infeksjon analyser. For optimal interaksjon av patogener med HIBCPP celler under assayene, blir bakteriene innledningsvis lagt inn i det øvre kammer i cellekulturen filterinnsatsen system. For å muliggjøre smitte fra den apikale eller den basolateral celleside, henholdsvis, har to varianter av in vitro-system vært established: I standardsystemet HIBCPP Cellene blir sådd ut i det øvre rom av filterinnsatsen, etterligne den situasjon når mikroorganismene er plassert på CSF-side og komme i kontakt med den apikale side av cellene (figur 1A, C). I motsetning til ved hjelp av HIBCPP celler i en omvendt cellekultur filterinnsats system gjenspeiler forholdene når bakterier har kommet inn i blodstrømmen. Mikroorganismer spre i blodet og støter CP epitelceller fra den basolateral side (figur 1 B, D). Verdt å merke seg, i dette modellsystemet er det blitt vist at bakterier invadere HIBCPP celler i et polart måte spesielt fra basolateral celleside 5,7.
Deretter til infeksjon av CP, kan de invaderte patogener bli gjenkjent av det medfødte immunsystemet gjennom ligation til mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS). Godt beskrevet medlemmer av PRRS tilhører Toll-like receptor (TLR) familie. kan TLRs bind for å karakteristiske strukturer av smittsomme mikroorganismer, som er betegnet patogen-assosiert molekyl mønstre (PAMPs). Ligering av reseptorene fører til aktivering av vertscellesignalisering kaskader som utløser ekspresjon av cytokiner og kjemokiner 12, som i sin tur stimulerer transmigrasjon av immunceller på tvers av BCSFB 13,14. Det har vist seg at HIBCPP celler uttrykker flere TLRs på mRNA-nivå og at infeksjon med N. meningitidis fører til utskillelse av flere cytokiner og chemokiner, inkludert CXCL1-3, IL6, IL8 og TNFa 15,16.
Her beskriver vi dyrking og infeksjon av human cellelinje HIBCPP i en omvendt cellekultur innsatsen system som gjenspeiler BCSFB. Dette modellsystem gjør det mulig å studere interaksjoner av patogener med in vivo aktuelle basolateral celle side så vel som den etterfølgende cellulære respons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitelceller CP danner BCSFB som skiller CSF fra blodet 2,3. Vi har nylig etablert HIBCPP cellelinjen som en funksjonell menneskelig modell av BCSFB. Cellene vise viktige barriere funksjoner av BCSFB in vitro, inkludert utvikling av en høy membranpotensialet, en lav permeabilitet for makromolekyler, så vel som tilstedeværelse av kontinuerlige tråder av TJS 5. TJ proteiner som bidrar til en apikal / basolateral polaritet av cellene. Polariteten er av stor betydning for en rettet lokalis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus – a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N’Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
