Продвижение 3-D агрегацию FACS Очищенная тимуса эпителиальных клеток с ЕАК 16-II / EAKIIH6 самосборки гидрогеля
Summary
This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.
Abstract
Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.
Introduction
Тимус является первичным лимфоидной органом, ответственным за генерацию различных слоев населения патоген-реактивная, уверенных терпимы Т-клеток, имеет важное значение для функции приобретенной иммунной системы. Это динамичный орган, в котором развивающиеся тимоциты, иммигрировал из костного мозга в качестве клеток-лимфоцитов-предшественников, мигрируют через губчатую трехмерные (3-D) матрицы тимуса стромы, подвергаются LINEAGE-спецификации и дифференциации, и в конечном счете эмигрировать в зрелых Т-клеток. Успех этого хорошо запрограммированный процесс во многом зависит от перекрестных помех между мигрирующими тимоцитов и жилых тимуса эпителиальных клеток (ТИК), преобладающей популяции вилочковой стромы, которые имеют важное значение для установления и поддержания целостности вилочковой микросреды.
На основе их анатомического расположения и уникальной функции, ТЭМ можно разделить на два подмножества: ТИКи в коре (cTECs), которые являются responность за выбор собственного MHC (главный комплекс гистосовместимости) ограничено Т-клетки (положительный выбор), а ТИК в мозговом веществе (mTECs), которые необходимы для устранения аутореактивных Т-клеток (негативный отбор) 1,2. Многие факторы (например, старение, инфекции, облучение, лекарственное лечение) может вызвать необратимые повреждения тимуса эпителия, что приводит к скомпрометированных адаптивного иммунитета. Несмотря на многочисленные попытки, восстановление функции тимуса была сложной задачей из-за трудностей, чтобы воспроизвести тимуса микросреду. Следует отметить, что вилочковой трехмерные (3-D) , конфигурация имеет решающее значение для выживания и функции ТЭМ, тогда как ТЭМ культивируют в среде 2-D быстро уменьшают экспрессию генов , критических для тимопоэз 3,4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) и С-концевой histidinylated аналог EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) имеют низкий молекулярный вес, амфифильные олигопептиды, которые растворяются в деионизованной водоснаг, но подвергаются гелеобразование с образованием бета-фибриллы при воздействии ионной силы выше, чем 20 мМ NaCl (нормальной концентрации соли в жидкости тела человека составляет 154 мм). Это свойство отзывчивым окружающей среды делает их универсальными строительными блоками для формирования 3D-структур. His-метки на EAKII-H6 обеспечивает стыковочный механизм, с помощью которого противопехотные Его IgGs / Fc-связывающий рекомбинантный белок A / G (αH6: пА / G) комплексы могут служить в качестве адаптера для закрепления белковых лекарственных средств и других биомолекул ( например, антитела) на гидрогеля композита 5-8.
Ранее мы показали , что флуоресцентные меченных молекул IgG , базирующуюся на гидрогеля может удерживаться в месте инъекции в течение до 13 дней 9. Кроме того, когда αH6: пА / G адаптеры с прикрепленные анти-CD4 IgG , были добавлены к EAK16 II / EAKIIH6 (ЕАК) гидрогеля, CD4 + Т – клетки были специально захваченный 10. Используя подобную технику, мы недавно показали, что 3-D агрегация TECS Cульд быть повышен в ЕАК гидрогеля с адаптером комплексов, несущих ПЭС-специфических анти-EpCAM антител (αH6: Pa / G: αEpCAM). Когда пересаживают под почки капсулы голых мышей, КТР кластеры , встроенные в ЕАК гидрогеля может эффективно поддерживать развитие функциональных Т – клеток в естественных условиях 11,12.
Здесь мы проиллюстрируем наш метод, чтобы быстро и эффективно очищают ТИК с сортировкой флуоресцентно активированных клеток (FACS) и генерировать 3-D TEC агрегаты с системой EAK гидрогеля.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как ТЭМ являются преобладающими популяция вилочковой стромы и играют существенную роль для структуры и функции тимуса желез, они составляют лишь около 0,1-0,5% от общего тимуса клеточности. Они также являются хрупкими клетки , как высокий процент гибели клеток изредка наблюдаю?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения грантов R21 AI113000 (WSM) и R01 AI123392 (YF).
Materials
| 1. TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5mL Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100um Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Cell sorting | |||
| 5mL Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2uL per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10uL per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10uL per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. EAK gel assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5mL microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10mg/mL | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5mg/mL | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100X) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
