עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה
Summary
העיצוב והפיתוח של assay colorimetric nanoparticle aptamer-זהב לצורך זיהוי של מולקולות קטנות עבור in-the-שדה יישומים נבדק. בנוסף, יישום colorimetric חכם-התקן (אפליקציה) קיבלה תוקף ו אחסון לטווח ארוך של assay הוקמה לשימוש בתחום.
Abstract
העיצוב והפיתוח של ננו-חלקיקים aptamer-זהב (AuNP) assay colorimetric לצורך זיהוי של מולקולות קטנות עבור in-the-שדה יישומים נבדק. יעד מבחני צבע סלקטיבי מבוסס AuNP פותחו הגדרות במעבדה הוכחה של קונספט מבוקר. עם זאת, תוכניות אלה לא הופעלו עד לנקודה של אי לקבוע השימוש המעשי שלהם מעבר להגדרות מעבדה. עבודה זו מתארת גישה גנריות כדי לתכנן, לפתח, ולפתור ב assay colorimetric aptamer-AuNP עבור analytes מולקולה קטנה באמצעות assay עבור in-the-שדה הגדרות. Assay הוא יתרון משום aptamers adsorbed passivate משטחים ננו-חלקיקים ולספק אמצעי לצמצם ולמנוע תגובות חיוביות כוזבות analytes היעד הלא. מעבר למערכת זו שימושים מעשיים הנדרשת בהגדרה לא רק את חיי המדף של assay aptamer-AuNP, אלא מאשש שיטות ונהלים להארכת capabil האחסון לטווח הארוךities. כמו כן, אחת הדאגות מוכרת עם ההודעה colorimetric הוא את הנטל שהועמס על אנליסטים לזהות במדויק לעתים קרובות שינויים קלים בצבע. כדי להפחית את האחריות על אנליסטים בתחום, פרוטוקול ניתוח צבע נועד למלא את תפקידי זיהוי צבע ללא צורך בביצוע משימה זו על ציוד מעבדה כיתה. השיטה ליצירה ובדיקת פרוטוקול ניתוח נתונים מתוארת. עם זאת להבין ולהשפיע על העיצוב של מבחני aptamer adsorbed, האינטראקציות קשורות aptamer, היעד, ואת AuNPs דורשת מחקר נוסף. הידע שנצבר יכול להוביל תפירת aptamers עבור פונקציונליות משופרת.
Introduction
Colorimetry הוא אחת הטכניקות העתיקות ביותר בשימוש בכימיה אנליטית. עבור טכניקה זו, קביעה איכותית או כמותית של אנליטי שתעלה בהתבסס על ייצור של תרכובת בצבע 1. בדרך כלל, מבחני צבע להשתמש ריאגנטים כי לחוות שינוי צבע בנוכחות של מיני אנליטי, שתוצאתה שינוי צבע נצפה או לגילוי בספקטרום האור הנראה. Colorimetry נעשה שימוש זיהוי של מטרות, החל אטומים, יונים, ומולקולות קטנות למולקולות ביולוגיות מורכבות כגון חומצות deoxyribonucleic (DNA), פפטידים, חלבונים 2-4. במשך שני העשורים האחרונים, ננו חולל מהפכה בתחום מבחני איתור, במיוחד עם מבחנים מבוססים צבע 5-6. שילוב התכונות הכימיות ופיסיקליות הייחודיות של ננו עם אלמנט הכרת סלקטיבית היעד, כגון נוגדנים, aptamers oligonucleotide או aptamers פפטיד, הוביל אל תחייתה in בתכנון ופיתוח של מבחני זיהוי colorimetric 7.
חלקיקי מתכת יש נכס שינוי צבע גודל תלוי הפגין, אשר נוצל בעיצוב של מבחני colorimetric רבים. חלקיקי זהב (AuNPs) הם בעלי עניין מיוחד בשל שינוי צבע אדום-אל-כחול ייחודי, כאשר הפתרון של חלקיקים מפוזרים מושרה כדי לצבור 8, בדרך כלל באמצעות תוספת מדויקת של מלח. היכולת לשלוט על המעבר מן התפזר (אדום) אל המדינות המצטברות (הכחולה) הובילה ליצירת חיישני colorimetric עבור יוניים, קטן מולקולרי, פפטיד, חלבון, ומטרות הסלולר 2-4,9. רבים של חיישנים אלה להעסיק aptamers כמוטיב זיהוי מטרות.
Aptamers הוא DNA או חומצה ריבונוקלאית (RNA) מולקולות שנבחר מתוך מאגר אקראי של 10 12 -10 15 רצפים שונים 10-11. תהליך הבחירה מזהה מחדש יעדאלמנטים קוגניציה עם זיקות מחייבות במשטר nanomolar הנמוך, ואת האבולוציה השיטתית של ligands על ידי עשרת מעריכים (Selex) הוא התהליך ביותר הידוע בכינויו 12-13. יתרונותיו של aptamers המבוסס oligonucleotide עבור יישומי חישה כוללים וקלות הסינתזה, שינוי כימי לשליטה, ואת יציבות כימית 14-15.
גישה אחת יצירת assay colorimetric משלבת ננו עם אלמנטי הכרה, מורכב משלב שני המינים הללו באמצעות הספיחה הפיסית של מולקולות aptamer-DNA למשטחי AuNP. דרך-aptamer היעד מחייב, aptamer חווה שינוי מבני 16-18, שמשנה את האינטראקציה של aptamer עם המשטח AuNP, מה שמוביל בתגובה צבע אדום-אל-כחול מושרה 19 בתוספת מלח. תכונה מדהימה זו של AuNPs מספקת מנגנון תגובה colorimetric הנצפה למכשירים מבוססי aptamer שניתן להשתמש לדהלחתום מבחני colorimetric עבור analytes שונים.
מבחני צבע המעוצבים באמצעות הלא קוולנטיים, aptamers DNA adsorbed פיזית על משטחי AuNP יש את הסטיגמה של להיות פלטפורמת חיישן חלשה עקב בעיות עם איתנות, נטייה לכישלון מחוץ הגדרות מעבדה מבוקרות, וחוסר המידע הזמין לשימוש מעשי הגדרות. עם זאת, assay colorimetric מבוסס aptamer-AuNP היה עניין בגלל הפשטות של פעולה ותגובה צבע הנצפה. מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול בתכנון, פיתוח, תפעול, צמצום השטח הקשורים תשובה חיובית כוזבת, אחסון לטווח ארוך של מבחני colorimetric מבוסס DNA-AuNP באמצעות קוקאין כמו אנליטי נציג. יתר על כן, הצענו גישה assay aptamer adsorbed זו (איור 1) כמו להיות יתרון בשל הפשטות וקלות השימוש שכתוצאה ממנה בפחות שלבים מאשר הגישה המקובלת עבור התחת אלה aptamer-AuNPays. עבור assay זה, aptamer נוספה לראשונה AuNPs, אשר הורשו לספוג אל פני השטח במשך תקופה ארוכה של זמן. יתרון נוסף לגישה זו היה צמצום בתגובה מולקולות אנליטי יעד שאינו קשור אינטראקציות פני AuNP. עם זאת, הירידה בתגובה חיובית כוזבת הייתה על חשבון רגישות assay. לכן איזון בין הגנת משטח ונגישות אנליטי יש צורך לשמור על תפקוד נאה assay. יתר על כן, פגם עמוק ועיקרי של ניתוח מבחני צבע באמצעים אחר מלבד עם המכשור הוא כי התוצאות הן בדרך כלל סובייקטיבי פתוחים לפרשנות אנליסט אל אנליסט, במיוחד כאשר מנסים לבדל הבדלים דקים בצבע. לעומת זאת, ישנם מספר נושאים עם קבלת במכשור מעבדה מבוסס שמיש מחוץ למעבדה, כגון זמינות של כוח, פרקטיות עם ניידות, וכו 'בעבודה זו, פרוטוקול ניתוח צבע פותחה עבור מורדואר ניידות לבטל חלק את הניחושים נפוצים הקשורים פרשנות assay מבוסס צבע 20-21. בהשוואה לגישות קודמות, המאמץ הזה שאף לדחוף מבחנים אלה עד קצה גבול היכולת שלהם עבור יישומים מעבר הגדרות במעבדה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך העשור האחרון, מבחני colorimetric מבוסס ננו-חלקיקים פותחו לצורך זיהוי של מטרות כוללים מולקולות קטנות, DNA, חלבונים, תאים 2-4. מבחני המשתמשות DNA-aptamers עם חלקיקים כבר צובר ריבית. בדרך כלל, מבחני colorimetric אלה מבוצעים על ידי ערבוב-aptamer דנ"א עם מולקולות אנליטי ואחריו בנוסף …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded by the Air Force Office of Scientific Research and the Assistant Secretary of Defense for Research and Engineering (Defense Biometrics and Forensics Office). JES participation was supported by a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratory.
Materials
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 mL Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
References
- Housecroft, C., Constable, E. . Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , 349-353 (2006).
- Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).
- Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells. Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).
- Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. Gold nanoparticles for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).
- Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. Aptamer in bioanalytical applications. Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).
- Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Chávez, J., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
- Alivasatos, A., et al. Organization of nanocrustal molecules using DNA. Nature. 382, 609-611 (1996).
- Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers. Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).
- Liu, J., Lu, Y. Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles. Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).
- Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin. J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).
- Hermann, T., Patel, D. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science. 287 (5454), 820-825 (2000).
- Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).
- Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. Aptamer-based biosensors. TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).
- Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles. Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).
- Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles. Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).
- Chávez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).
- Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Li, H., Rothberg, L. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells. Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).
- Martin, J., Chávez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
- Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. Point-of-care colorimetric detection with a smartphone. Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).
- Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil. Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).
