A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.
रीयल टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन भी मात्रात्मक पीसीआर (क्यू पीसीआर) के रूप में जाना जाता है माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया उपकरण पर्यावरण के नमूनों में वर्गीकरण और कार्य समूहों के जीन प्रचुरता यों की है। एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस रिएक्शन (आरटी-क्यू पीसीआर) के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया, यह भी जीन टेप यों को नियोजित किया जा सकता है। क्यू पीसीआर अत्यधिक संवेदनशील फ्लोरोसेंट का पता लगाने chemistries कि प्रतिक्रिया का तेजी के चरण के दौरान पीसीआर amplicons की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देने का उपयोग करता है। इसलिए, 'अंत बिंदु' पीसीआर के साथ जुड़े पूर्वाग्रहों पीसीआर प्रतिक्रिया के पठार चरण में पता चला परहेज कर रहे हैं। एक प्रोटोकॉल वास्तविक समय पीसीआर के माध्यम से प्रदान की जाती है तटीय अवसादों से बैक्टीरियल -16 rRNA जीन और टेप यों की। सबसे पहले, डीएनए और डीएनए से मुक्त शाही सेना की तैयारी के लिए आवश्यक अतिरिक्त कदम सहित तटीय अवसादों से शाही सेना के सह निकासी के लिए एक विधि है, उल्लिखित है। दूसरा, -16 rRNA जीन और टीआर की मात्रा का ठहराव के लिए एक कदम दर कदम गाइडक्यू पीसीआर और आरटी-क्यू पीसीआर के माध्यम से निकाले न्यूक्लिक एसिड से anscripts उल्लिखित है। यह डीएनए और आरएनए मानक घटता के निर्माण के लिए विवरण शामिल हैं। माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में आर टी-क्यू पीसीआर assays के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण विचार शामिल किए गए हैं।
सूक्ष्मजीवों बायोस्फीयर ड्राइविंग पारिस्थितिकी तंत्र समारोह के कोने-पत्थर हैं। सूक्ष्मजीवों के बहुमत असभ्य 1 रहते हैं। इसलिए आणविक आधारित दृष्टिकोण विविधता और पर्यावरण में सूक्ष्मजीवों के समारोह के बारे में हमारी समझ को अग्रिम करने के लिए मौलिक हैं। इन तरीकों को केन्द्रीय पर्यावरण के नमूनों से न्यूक्लिक एसिड की निकासी और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग कर लक्ष्य जीन के बाद प्रवर्धन है।
डीएनए / आरएनए निकासी का पहला कदम है, माइक्रोबियल समुदाय वर्तमान की सेल दीवारों lyse अवांछित गैर न्यूक्लिक एसिड अणु (जैसे, कार्बनिक और अकार्बनिक पदार्थ) को हटाने और आगे बहाव के विश्लेषण के लिए समाधान में बनाए रखने के डीएनए / आरएनए करना है। कई वाणिज्यिक निकासी किट की एक सीमा सहित साहित्य 2,3,4,5 में उपलब्ध विकल्पों के अलावा, ग्रीफिथ विधि 6 व्यापक रूप से 7,8,9 कार्यरत है। यह लागत प्रभावी और देहात हैrticularly अच्छी तरह से अवसादों के लिए अनुकूल के रूप में यह कोशिकाओं lyse करने के लिए एक मनका पिटाई कदम का उपयोग करता है और इस तरह के humic एसिड के रूप में पीसीआर अवरोधकों के सह निकासी को कम करने whilst एक साथ डीएनए और आरएनए उबरने के कदम शामिल हैं।
दूसरे चरण के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करता है ऐसे -16 rRNA वर्गीकरण मार्कर के रूप में लक्ष्य जीन, बढ़ाना, निकाले न्यूक्लिक एसिड से। यह दृष्टिकोण है और uncharacterized माइक्रोबियल ब्लैक बॉक्स 10,11 के अन्वेषण की सुविधा के लिए जारी है। हालांकि, अंत बिंदु पीसीआर आधारित विधियों विभिन्न सीमाओं से ग्रस्त है कि पूर्वाग्रह कर सकते हैं माइक्रोबियल समुदायों 12 की विशेषता। सही जीन / प्रतिलेख प्रचुरता यों, वास्तविक समय पीसीआर भी मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) के रूप में जाना जाता इस्तेमाल किया जाना चाहिए। qPCR फ्लोरोसेंट रिपोर्टर डाई प्रणाली है कि पीसीआर के हर चक्र के बाद amplicon संचय ट्रैक का लाभ उठाते। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह मतलब है कि मात्रा का ठहराव जल्दी घातीय चरण के दौरान हो सकता है, बल्किअंत बिंदु, पीसीआर प्रतिक्रिया के चरण, जब amplicon उपज अभी भी सीधे लक्ष्य जीन की प्रारंभिक बहुतायत के लिए आनुपातिक है की तुलना में।
दो रिपोर्टर प्रणालियों आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं: एक intercalating न्यूक्लिक एसिड दाग 13 और डीएनए पोलीमरेज़ 14 के 5 '3' exonuclease गतिविधि। चूंकि पूर्व संवाददाता प्रणाली सभी डबल असहाय डीएनए के लिए indistinctively बांधता है, यह लक्ष्य अनुक्रम का एक overestimation को जन्म दे सकती है, तो अवांछित गैर विशिष्ट amplicons या उत्पादों से प्राइमर dimers होते हैं। आदेश में इस को नाकाम करने के लिए, प्रवर्धन के व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। उत्तरार्द्ध प्रणाली में, टेम्पलेट प्रवर्धन Taq पोलीमरेज़ कि cleaves एक आंतरिक जांच से एक fluorophore की एक 5 'nuclease गतिविधि का एक संयोजन का उपयोग कर लगाया जाता है। यह सुविधा एक fluorogenic जांच के उपयोग कि पूरक लक्ष्य विशिष्ट sequenc करने के लिए केवल बांधता के कारण परख की विशिष्टता बढ़ जाती हैप्राइमर जोड़ी के बीच ई। दोनों chemistries के साथ मात्रा का ठहराव क्रासिंग सूत्रीय (सीपी) जहां पीसीआर amplicons के संचय, के रूप में प्रतिदीप्ति में वृद्धि के द्वारा मापा जाता है, काफी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति ऊपर है निर्धारित करने से हासिल की है।
qPCR बड़े पैमाने पर अलग अलग वातावरण में 15 में जीन की प्रचुरता निर्धारित करने के लिए माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, सीडीएनए को शाही सेना के रिवर्स प्रतिलेखन qPCR और RT-qPCR के साथ संयुक्त है जीन अभिव्यक्ति यों की। इसलिए, qPCR और RT-qPCR पर्यावरण के नमूनों के भीतर जीन और / या प्रतिलिपि संख्या की मात्रा का ठहराव के लिए तेजी से, प्रभावी तरीकों में प्रतिनिधित्व करते हैं।
तटीय अवसादों में सूक्ष्मजीवों कार्बनिक पदार्थ की खनिज, प्रदूषण की गिरावट और जैसे नाइट्रोजन 16,17,18 के रूप में macronutrients के biogeochemical साइकिल चालन सहित विभिन्न पारिस्थितिकी तंत्र प्रक्रियाओं, ड्राइव। इन परिवर्तनों का व्यापक समझ के लिए एक व्यापक लेखा और लेखा की आवश्यकता हैजीन और प्रतिलेख प्रचुरता पर मात्रात्मक डेटा सहित योगदान माइक्रोबियल आबादी, टी। यहाँ हम तटीय अवसादों में बैक्टीरिया -16 rRNA जीन और प्रतिलेख प्रचुरता की मात्रा का ठहराव के लिए अच्छी तरह से परीक्षण, सुव्यवस्थित और मानकीकृत प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला शुरू। प्रोटोकॉल नमूना संग्रह, एक साथ डीएनए और आरएनए निकासी, डीएनए से मुक्त आरएनए तैयारी, निकाले न्यूक्लिक एसिड की गुणवत्ता की जाँच, -16 rRNA-डीएनए और -RNA मानकों और पर्यावरण के नमूनों की मात्रा का ठहराव की पीढ़ी की रूपरेखा। यहाँ वर्णित विधि से निकाली गई मात्रात्मक डेटा तटीय पारिस्थितिक तंत्र ड्राइविंग माइक्रोबियल समुदायों पर प्रकाश डाला करने की जरूरत है।
qPCR के साथ डीएनए / आरएनए निष्कर्षण के संयोजन एक तेजी से, सही, अपेक्षाकृत लागत प्रभावी ऐसे तटीय तलछट के रूप में पर्यावरण के नमूने, की एक सीमा से जीन और प्रतिलेख प्रचुरता के संवेदनशील मात्रा का ठहराव के लिए तरीका प्रदान करता है।
प्रारंभिक न्यूक्लिक एसिड निकासी माइक्रोबियल समुदाय की एक प्रतिनिधि दृश्य 22 हासिल की है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम है। क) कुल सेल की उपलब्धि, ख) निरोधात्मक यौगिकों (जैसे, humic एसिड या polyphenolics के सह निकासी), ग) आरएनए अंश में दूषित डीएनए, घ): सीमाओं के एक नंबर निकासी प्रोटोकॉल के लिए विचार किया जाना चाहिए निकाले न्यूक्लिक एसिड का तेजी से क्षरण जब संग्रहीत। सावधानियां आदेश में इन सीमाओं को नाकाम करने में लिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, विशेष रूप से देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि न्यूक्लिक एसिड की निकासी नमूना प्रकार (जैसे, तलछट, मिट्टी, अपशिष्ट, आदि के लिए अनुकूलित है लिया जाना है)। न्यूक्लिक एसिड उपज और दोनों डीएनए और आरएनए के लिए गुणवत्ता में महत्वपूर्ण सुधार प्रारंभिक प्रयोगों 23 से बाहर ले जाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। पीसीआर आधारित अनुप्रयोगों 24 पर निरोधात्मक यौगिकों के प्रभाव को कम करने के लिए, निकाले डीएनए और आरएनए से dilutions की एक श्रृंखला का परीक्षण करें। कई फ्रीज पिघलना चक्र से निकाले गए डीएनए / आरएनए का तेजी से क्षरण को नाकाम और -80 डिग्री सेल्सियस पर आनुवंशिक जानकारी के संभावित नुकसान, स्टोर कई छोटी मात्रा aliquots से बचने के लिए।
सावधानी से तैयार है, qPCR एक मजबूत, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और संवेदनशील तरीका है। विशेष रूप से, प्रवर्धन और मानक वक्र निर्माण के लिए तरीकों इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित हित के किसी भी जीन लक्ष्य, अन्य वंशावली मार्कर (यानी, अर्चेअल -16 rRNA, फंगल 18S rRNA) या वातावरण में महत्वपूर्ण कार्यों में शामिल जीन सहित के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। qPCR के उपयोग में ज्ञात सीमाएं हैं: एक) प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उच्च गुणवत्ता रों की पीढ़ीपूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए tandard वक्र, ख) प्राइमर / जांच के चुनाव और क्यू पीसीआर परख शर्तों के अनुकूलन, ग) कम गुणवत्ता / sheared न्यूक्लिक एसिड, घ) डीएनए / आरएनए का काम कर रहे कमजोर पड़ने की पसंद का उपयोग निषेध से बचने के लिए । इसके अलावा, यह है कि qPCR तकनीक जीन / प्रतिलेख प्रचुरता है जो मायने रखता है सेल के लिए समानता नहीं कर सकते हैं प्रदान करता है पर विचार किया जाना है: यह विशेष रूप से मामला है जब 16S और 18S rRNA जीन को निशाना बनाया जाता है, के रूप में सूक्ष्मजीवों उनके जीनोम में ribosomal जीन के विभिन्न प्रतिलिपि संख्या है 25।
खराब गुणवत्ता मानक घटता हित के जीन की गलत मात्रा का ठहराव में परिणाम होगा। यह छोटे aliquots में उच्च एकाग्रता के मानकों से ताजा मानक घटता बनाया जा सकता है के एक शेयर की दुकान के लिए अच्छा अभ्यास है। मानक घटता दुकान नहीं है, हमेशा सर्वोच्च एकाग्रता हर बार के एक शेयर से ताजा dilutions बनाओ। पर्यावरण के नमूनों की सही मात्रा का ठहराव के लिए स्टेन की सांद्रता की सीमा सुनिश्चितदर्द की अवस्था अज्ञात नमूनों की उम्मीद सी.पी. मूल्यों तक फैला है। जब टेप बढ़ाता, आरएनए फंसे डीएनए डबल नहीं से मानक वक्र का निर्माण। जब संभव हो, नमूने सीधे तुलना में किया जा करने के लिए की मात्रा का ठहराव अंतर-परख भिन्नता 20 से बचने के लिए एक एकल परख के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। यह हमेशा संभव नहीं हो सकता है। इसलिए, assays के बीच उत्पन्न जीन प्रचुरता तुलना करने के लिए यह assays के बीच दोहराया नमूनों की एक यादृच्छिक उप-सेट करने के लिए सलाह दी जाती है। प्राइमर और जांच सेट की एक विस्तृत चयन वर्तमान में qPCR माइक्रोबियल taxa और कार्य समूहों जब इन लक्ष्य समूह के लिए दोनों अधिक से अधिक कवरेज और विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए का चयन 15. सावधानी से विचार की जरूरत है लक्षित करने के लिए उपलब्ध हैं। यदि एक qPCR परख की प्रतिक्रिया दक्षता संतोषजनक नहीं है, समस्या निवारण विभिन्न थर्मल साइकिल चालन की स्थिति, परीक्षण और / या प्रतिक्रिया की स्थिति, जैसे (annealing समय और / या तापमान के रूप में) प्राइमर जांच सांद्रता के साथ अलग से शुरू होता है। हेnce क्यू पीसीआर परख और प्रतिक्रिया की स्थिति अनुकूलित कर रहे हैं, हमेशा उचित टेम्पलेट एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए डीएनए / सीडीएनए dilutions की एक श्रृंखला के एक प्रारंभिक परीक्षा का आयोजन करेगा। कमजोर पड़ने रेंज आगे assays के लिए इष्टतम टेम्पलेट कमजोर पड़ने के रूप में उच्चतम प्रतिलिपि संख्या में जिसके परिणामस्वरूप का चयन करें।
वर्तमान में, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों कुशलता से वातावरण 26,27,28 के ढेर में माइक्रोबियल समुदाय संरचना और कार्यों पर प्रकाश डाला। हालांकि, इन डेटासेट अक्सर अंत बिंदु पीसीआर amplicon पुस्तकालयों के आधार पर कर रहे हैं और इसलिए विशेष taxa की बहुतायत के केवल अर्द्ध मात्रात्मक आकलन प्रदान करते हैं। इसलिए, वास्तविक समय पीसीआर आधारित तकनीक की क्षमता विशिष्ट वर्गीकरण मार्कर निशाना बनाने के लिए (तनाव के स्तर तक नीचे उच्च डोमेन से) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा प्राप्त परिणामों के कुशल सत्यापन की अनुमति देता है। इसके अलावा, qPCR सफलतापूर्वक स्थिर आईएसओ के रूप में अन्य माइक्रोबियल पारिस्थितिकी आणविक विधियों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया हैटोपे की जांच कर रही (एसआईपी) या वंशावली / कार्यात्मक प्रोटीन। पूर्व उपकरण के साथ संयुक्त, qPCR पाचन सक्रिय समुदाय 29,30 यों इस्तेमाल किया जा सकता है। जब माइक्रोएरे विश्लेषण के साथ संयुक्त, qPCR वातावरण 31,32 की वंशावली मार्कर आधारित और कार्यात्मक जीन सर्वेक्षण के प्रमुख मात्रात्मक व्याख्या प्रदान करता है।
इसलिए, चाहे अकेले या अन्य (अक्सर प्रक्रिया आधारित) पारिस्थितिकी तंत्र समारोह के आकलन के साथ संयोजन में उपयोग किया, मात्रात्मक पीसीआर माइक्रोबियल समुदायों और पारिस्थितिकी तंत्र के कार्यों के बीच मायावी लिंक के अन्वेषण में माइक्रोबियल परिस्थिति के लिए एक अनिवार्य उपकरण है।
The authors have nothing to disclose.
इस प्रकाशन अनुदान संख्या NERC पूर्वोत्तर / JO11959 / 1 और विज्ञान फाउंडेशन आयरलैंड और CJS करने के लिए अनुदान संख्या 11 / SIRG / B2159awarded तहत मैरी क्यूरी कार्रवाई COFUND के तहत प्राकृतिक पर्यावरण अनुसंधान परिषद (NERC) की वित्तीय सहायता के साथ किए गए शोध से emanated गया है और पूर्वी शैक्षिक अनुसंधान कंसोर्टियम (पूर्वी एआरसी)।
Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
Chloroform:Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
Tryptone | Sigma | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
Ampicillin | Sigma | 59349 | |
X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
Agar | VWR | 20768.235 | |
Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
qPCR machine |