Tissue Engineering af Intrinsic Vaskularisering i en<em> In vivo</em> Tissue Engineering Chamber

Summary

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Abstract

I rekonstruktionskirurgi, der er et klinisk behov for et alternativ til de nuværende metoder til autolog genopbygning, som er komplicerede, dyre og handel en defekt for en anden. Tissue engineering holder løftet om at løse dette stigende efterspørgsel. Men de fleste væv engineering strategier undlader at generere stabile og funktionelle væv erstatninger på grund af dårlig vaskularisering. Dette papir fokuserer på et in vivo vævsmanipulation kammer model af iboende vaskularisering hvor en perfunderet arterie og en vene enten som en arteriovenøs sløjfe eller en gennemstrømning pedicle konfiguration ledes inde i et beskyttet hult kammer. I dette kammer-system sker angiogene spiring fra arteriovenøse skibe og dette system tiltrækker iskæmisk og inflammatorisk drevet endogene cellemigration som gradvist fylder kammeret med fibro-vaskulært væv. Eksogene celle / matrix implantation ved kammerets konstruktion forbedrer celle surVival og bestemmer specificiteten af ​​de konstruerede væv, der udvikler. Vores undersøgelser har vist, at dette kammer model succes kan generere forskellige væv, såsom fedt, hjertemuskel, lever og andre. Dog er modifikationer og raffinementer nødvendige for at sikre målvævet dannelse er konsekvent og reproducerbar. Denne artikel beskriver en standardiseret protokol til fremstilling af to forskellige vaskulariserede vævsmanipulering kammer modeller in vivo.

Introduction

Bearbejdning funktionel vaskulariseret væv ved hjælp af en tissue engineering tilgang er en spirende paradigme i regenerativ medicin. ^1,2 Mange tilgange til ingeniør nyt og sundt væv for udskiftning af skadede væv eller defekte organer er blevet udviklet, ^3-6 eksperimentelt i små dyremodeller med lovende kliniske potentiale. ^7,8 vaskularisering er dog fortsat en af de store udfordringer for tissue engineering begrænser dens potentiale til at vokse væv af klinisk relevant størrelse,. ⁹

Aktuelle tilgange til vaskularisere væv følge enten en ydre vej, hvor nye skibe vokser fra modtageren vaskulære seng og invadere hele implanterede væv konstruerer ¹⁰ eller en iboende vaskularisering sti, hvor vaskulaturen vokser og udvider i samklang med den nyligt udviklede væv. ¹¹ Den ydre tilgang traditionelt involverer seeding celler på et stilladsin vitro og implantere hele konstruktionen i levende dyr med den forventning, at næringsstoffer, der tidligere leveret af dyrkningsmedier, vil blive indkøbt fra kredsløbet. ^12,13 Konceptet er simpelt som vaskulær indvækst er for langsom, og kun meget tynde implantater (< 1-2 mm tyk) forbliver levedygtige. Forudsat næringsstoffer og ilt ved hjælp af en tilstrækkelig og hurtig vaskularisering er kernen i enhver vellykket forsøg på at vokse mere komplekse og større væv-manipuleret erstatninger såsom knogler, muskler, fedt og solide organer. ^14,15 Intrinsic vaskularisering rummer muligheder for større konstruktioner til at udvikle ved progressiv vækst af væv rimeligt forhold til dets ekspanderende blodforsyning. Et design er in vivo implantation ind i et kammer af en vaskulær stilken med eller uden en celle seedede stillads. ^5,6 Dette har banet vejen for nye procedurer for generering af tykkere uløseligt vaskulariserede væv. ^16,17 </ P>

For nylig er strategier blevet udviklet til at pre-vaskularisere vævstransplantater, før implantation. Disse indarbejdet blodkarrenes netværk har til formål at inosculate med værten fartøjer på implantation giver mulighed for hurtig levering af en komplet blodforsyning for at forbedre overlevelsen af alle dele af et transplanteret tyk vævstransplantat. ¹⁸

Vi banebrydende en in vivo vaskulariseret væv teknisk model i små dyr, der involverer en subkutant implanteret halvstiv lukket rum indeholdende en perfunderes vaskulær stilken og celleholdige biomaterialer. Kammeret skaber et iskæmisk miljø, der stimulerer angiogene spiring fra de implanterede fartøjer. ³ Den vaskulære stilken kan enten være en rekonstrueret arteriovenøs sløjfe eller en intakt gennemstrømning arterie og vene. ^3-6,19 Denne vaskulære pedicle spirer en velfungerende og omfattende arteriovenøse -capillary-venøs netværk, der forbinder både teknikkeneriole og venøs slutter med vaskulære stilken. ^3,20 Endvidere omgivende hule bærekammeret beskytter det udviklende væv fra potentielt deformerende mekaniske kræfter og forlænger den iskæmiske drev kan forbedre vaskularisering. ^3,21,22 Hvis fartøjet stilken simpelthen implanteres i normalt væv og ikke inde i beskyttede rum af kammeret, angiogene spiring ophører langs den samme tidslinje som en normal såret og ingen nye væv vil akkumulere omkring stilken. Forskere har anvendt denne in vivo konfiguration til frembringelse tredimensionale funktionelle vaskulariserede vævskonstruktioner med støttende vaskulatur og klinisk relevant størrelse. ^4,23 Endvidere kan de manipulerede vaskulariserede vævskonstruktioner med dens intakte vaskulær pedicle høstes beregnet til udplantning på skadestedet . ^24,25 En mere klinisk mulig scenarie ville være at skabe kammeret i den endelige site for genopbygning sn sådan som brystet. Således kunne denne de novo tissue engineering tilgang har klinisk potentiale til at tilvejebringe en ny kilde til funktionelle målvæv for rekonstruktionskirurgi. ^26-28

Følgende protokol giver en generel vejledning til at konstruere en in vivo vaskulariseret vævsteknik kammer i rotter, som kunne tilpasses i forskellige dyremodeller og anvendes til at undersøge de indviklede processer angiogenese, matrixproduktion, og den cellulære migration og differentiering.

Protocol

De her beskrevne protokoller er blevet godkendt af Animal Ethics Committee of St. Vincents Hospital Melbourne, Australien, og blev gennemført under streng overholdelse af de australske National Sundhed og Medicinsk Research retningslinjer fra Rådet. BEMÆRK: To kammer protokoller er beskrevet nedenfor. De to forskellige modeller og deres specifikke chamber designs er illustreret i figur 1. Chamber (1) er fremstillet af polycarbonat (for rotte-arteriovenøs loop kammer model). Det er cylindrisk med en indre diamete…

Representative Results

Den mikrokirurgisk skabelse af vævsteknologiske kamre blev udført som beskrevet i protokollen ovenfor. Væv genereret inde i kamrene kan undersøges histologisk som beskriver i protokol trin 3. Forskellige vævstyper med succes er blevet udviklet ved hjælp af in vivo vaskulariserede kammer (figur 2). Disse omfatter hjertevæv med neonatale rottecardiomyocytter (figur 2A), muskelvæv med rotte skeletmyoblaster (figur 2B), og f…

Discussion

Engineering af mikrocirkulationen undersøges i øjeblikket hovedsagelig gennem to tilgange. Den første indebærer at udvikle en yderst sammenhængende vaskulære netværk inden konstruktionen in vitro så når implanteret, kapillærer fra værten vaskulære seng forbinde med dem i den transplanterede konstruere gennem en proces kaldet inosculation, hvilket sikrer levering af næringsstoffer, ikke kun til periferien, men også til kernen. ^21,32,33 Dette kaldes præ-vaskularisering. Den anden fremgan…

Materials

1 15 Blade Scalpel	Braun	BB515
1 Toothed Adson Forceps	Braun	BD527R
1 Needle Holder	Braun	BM201R
1 Bipolar Coagulator	Braun	US335
1 Micro Needle Holder B-15-8.3	S & T	00763
1 Micro Dilator Forceps D-5a.2	S & T	00125
1 Micro Jeweler's Forceps JF-5	S & T	00108
1 Micro Scissors – Straight SAS-11	S & T	00098
1 Micro Scissors – Curved SDC-11	S & T	00090
2 Single Clamps B-3	S & T	00400
2 10/0 nylon suture	S & T	03199
1 6/0 nylon suture	Braun	G2095469
2 4/0 Silk Sutures	Braun	C0760145
Xilocaine 1%	Dealmed	150733	10 mg/ml
Heparin Sodium	Dealmed	272301	5000 UI / ml
Ringer Lactate	Baxter	JB2323	500 ml
1 dome-shaped tissue engineering chamber	custom made
1 flow-through chamber	custom made
Lectin I, Griffonia Simplicifolia	Vector Laboratories	B-1105	1.67 μg/mL
Troponin T antibody	Abcam	Ab8295	4 μg/mL
Human-specific Ku80 antibody	Abcam	Ab80592	0.06 μg/mL
Desmin antibody	Dako	M0760	2.55 μg/mL
Cell Tracker CM-DiI dye	Thermo Fisher Scientific	C-7000	3 mg/106 cells