ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة
Summary
Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Abstract
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
Introduction
ويتحقق وضع حاليا الخلايا واحدة على حدة في فضاء الثقافة عادة باستخدام الحد من التخفيف أو مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). بالنسبة لكثير من المختبرات، والحد من التخفيف هو وسيلة مريحة، لأنه يتطلب فقط ماصة والأنسجة لوحات الثقافة، والتي هي متاحة بسهولة. في هذه الحالة، يتم المخفف تعليق خلية متسلسل إلى كثافة الخلية المناسبة، ومن ثم وضعها في آبار الثقافة باستخدام ماصة اليدوية. ثم يتم استخدام هذه الخلايا وحيدة compartmented لتحليل الخلايا، مثل التباين الجيني فحص (1) ومستعمرة تشكيل 2. ومع ذلك، وهذه الطريقة منخفضة الإنتاجية والعمالة الكثيفة، دون اللجوء إلى استخدام ذراع روبوتية لمساعدة، لأن طبيعة توزيع بواسون من طريقة التخفيف الحد من تقيد الأحداث وحيدة الخلية إلى احتمال الحد الأقصى من 37٪ 3. يمكن آلات FACS مع الذراع الروبوتية متكامل التغلب على الحد من توزيع بواسون التي كتبها بدقة PLACجي خلية واحدة في الثقافة بشكل جيد في وقت 4. ومع ذلك، فإن ارتفاع إجهاد القص الميكانيكية (وبالتالي، خفضت بقاء الخلية) 5 وشراء آلة والتكاليف التشغيلية محدودة استخدامه في العديد من المختبرات.
للتغلب على القيود المذكورة أعلاه، تم وضع أجهزة الميكروسكيل لبكفاءة عالية تحميل الخلايا وحيدة في microwells 6. ومع ذلك، فإن microwells لا توفر مساحة كافية للخلايا تحميل لتتكاثر، وذلك بسبب الحاجة إلى جعل حجم كل microwell قريب من خلية واحدة لتحقيق أقصى قدر من وحيد الخلية احتمال التحميل. كما يطلب فحوصات الثقافة في العديد من التطبيقات المستندة إلى خلية (على سبيل المثال، فحص مولد الرمع 7)، microwells أكبر (90-650 ميكرون في القطر أو في طول الجانب) كما تم استخدامها للسماح للثقافات خلية طويلة. ومع ذلك، مثل طريقة التخفيف الحد، فإنها تمتلك أيضا منخفضة وحيدة الخلية الكفاءات تحميل، تتراوح بين 10 – 30٪ 89
سابقا، قمنا بتطوير منصة عالية الإنتاجية ميكروفلويديك لعزل الخلايا وحيدة في microwells الفردية وإظهار تطبيقه في فحص مولد الرمع للخلايا معزولة. وقدم 10 على الجهاز مع بولي dimethylsiloxane (PDMS)، وتضم مجموعتين من صفائف microwell مع أحجام microwell المختلفة، التي يمكن أن تحسن إلى حد كبير كفاءة في تحميل خلية واحدة في microwell له حجم أكبر بكثير من الخلايا. والجدير بالذكر أن يسمح هذا "ثنائي جيد" مفهوم حجم منطقة ثقافة لتعديلها بمرونة دون التأثير على كفاءة القبض على خلية واحدة، مما يجعلها واضحة لضبط تصميم الجهاز لتناسب أنواع مختلفة من الخلايا والتطبيقات. وينبغي أن تكون هذه الطريقة ذات الكفاءة العالية ومفيدة لتجارب زراعة الخلايا على المدى الطويل للدراسات خلية التجانس وحيدة النسيلة إنشاء خط الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظم جهاز المستندة إلى Microwell استخدمت 6،14 للتلاعب وحيدة الخلية والتحليل، مثل خلية واحدة على نطاق واسع لظاهرة الاحتباس 6 واحد الجذعية المكونة للدم تكاثر الخلايا 15. وعلى الرغم من حجم جيد والعدد والشكل يمكن تعديلها لتطبيقات محددة، ودائما يؤثر سلبا على كف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
Materials
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays – Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
