La consegna dei terapeutica siRNA al SNC Utilizzando cationici e anionici liposomi
Summary
The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.
Abstract
Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects.
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.
Introduction
I prioni sono gravi malattie neurodegenerative che colpiscono il sistema nervoso centrale. Le malattie da prioni risultano dalla misfolding della normale proteina prionica cellulare, PrP C, con un isomero infettiva chiamata PrP Res. Queste malattie colpiscono una grande varietà di specie, tra cui encefalopatia spongiforme bovina nelle vacche, la scrapie degli ovini, malattia del dimagrimento cronico nei cervidi, e la malattia di Creutzfeldt-Jakob nell'uomo 1-3. I prioni causano neurodegenerazione che inizia con la perdita sinaptica, e progredisce a vacuolizzazione, gliosi, perdita neuronale, e depositi di placca. Alla fine, con la conseguente morte dell'animale / individuale 4. Per decenni, i ricercatori hanno studiato i composti destinati a rallentare o arrestare la progressione della malattia da prioni. Tuttavia, i ricercatori non hanno trovato né una terapia di successo o un efficace veicolo di consegna sistemica.
Endogena espressione PrP C è necessario per lo sviluppo di malattie da prioni 5 </sup>. Pertanto, ridurre o eliminare espressione PrP C può provocare un ritardo o miglioramento della malattia. Diversi gruppi creati topi transgenici con ridotti livelli di PrP C o lentivectors iniettati esprimono shRNA direttamente nel tessuto cerebrale murino per studiare il ruolo dei livelli di espressione PrP C nelle malattie da prioni. Questi ricercatori hanno scoperto riducendo la quantità di neuroni PrP C provocato arrestare la progressiva neuropatologia delle malattie da prioni e esteso la vita degli animali 6-9. Ci hanno riferito che i risultati del trattamento PrP C siRNA a distanza di PrP Res nelle cellule di topo neuroblastoma 10. Questi studi suggeriscono che l'uso di terapie per diminuire i livelli di espressione PrP C, come small interfering RNA (siRNA), che scinde mRNA, può sufficientemente ritardare la progressione delle malattie da prioni. Tuttavia, la maggior parte delle terapie indagati per malattie da prioni sono stati consegnati in un modo che non sarebbe praticoin un ambiente clinico. Pertanto, una terapia siRNA bisogno di un sistema di erogazione sistemica, che viene trasportato via endovenosa e mirata al SNC.
Gli investigatori hanno studiato l'uso di liposomi come veicoli di consegna per i prodotti di terapia genica. lipidi cationici e anionici sono entrambi utilizzati nella formazione di liposomi. lipidi cationici sono più ampiamente usati di lipidi anionici perché la differenza di carica tra i lipidi cationici e il DNA / RNA permette di confezionamento efficiente. Un altro vantaggio di lipidi cationici è che attraversano la membrana cellulare più facilmente di altri lipidi 11-14. Tuttavia, lipidi cationici sono più immunogenico di lipidi anionici 13,14. Pertanto, i ricercatori hanno cominciato a spostarsi da utilizzare cationico per anionica lipidi nei liposomi. Prodotti per la terapia genica possono essere confezionati in modo efficiente nei liposomi anionici utilizzando la carica positiva solfato di protamina peptide, che condensa le molecole di DNA / RNA 15-19. Dal momento che Lipi anionicods sono meno immunizzanti lipidi cationici che possono avere un aumento dei tempi di circolazione, e possono essere più tollerati in modelli animali 13,14. I liposomi sono mirati a specifici tessuti utilizzando il targeting peptidi che sono attaccati ai liposomi. Il neuropeptide RVG-9r, che si lega ai recettori nicotinici, è stato utilizzato per indirizzare siRNA e liposomi al SNC 17-20.
Questo rapporto delinea un protocollo per la produzione di tre veicoli di consegna siRNA, e di confezionare e consegnare il siRNA per le cellule neuronali (Figura 1). complessi liposoma-siRNA-peptide (LSPCs) sono costituiti da liposomi con siRNA e RVG-9r di targeting peptide elettrostaticamente attaccati alla superficie esterna del liposoma. Peptide indirizzata incapsulata in liposomi terapeutici siRNA (PALETS) sono composte da siRNA e protamina incapsulato all'interno della liposomi, con RVG-9r covalentemente legato a gruppi di lipidi PEG. Utilizzando i metodi indicati per generare LSPCs e PALETS, PrP C siRNA riduce espressione PrP C fino al 90% in cellule neuronali, che detiene tremenda promessa per curare o sostanzialmente ritardare l'insorgenza della patologia malattia da prioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo rapporto descrive un protocollo per creare due sistemi di somministrazione mirata che trasporta in modo efficiente siRNA al sistema nervoso centrale. Precedenti metodi di somministrazione siRNA al SNC inclusi l'iniezione di vettori siRNA / shRNA direttamente nel cervello, iniezione endovenosa di mirati siRNA, o iniezione endovenosa di complessi liposomi-siRNA non mirati. L'iniezione di siRNA / shRNA vettori nel sistema nervoso centrale non provoca una diminuzione dei livelli di espressione della proteina …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the following funding sources: the CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) and the NIH research grant program (R01 NS075214-01A1). We would like to thank the Telling lab for the use of their monoclonal antibody PRC5. We would also like to thank the Dow lab for DOTAP liposomes, and for sharing their expertise in generating liposomes.
Materials
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2um filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40um Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary – PRC |
References
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of ‘intelligent’ liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
