mutagénese de direccionamento de genes é agora possível em uma ampla gama de microrganismos utilizando técnicas de edição genoma. Aqui, nós demonstramos um protocolo para mutagénese gene alvo usando ativador de transcrição como nucleases efetoras (TALENS) em Astyanax mexicanus, uma espécie de peixe que inclui peixes de superfície e cavefish.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Identificar alelos de genes subjacentes à mudança evolutiva é essencial para entender como e por que a evolução ocorre. Para esse fim, muitos trabalhos recentes se concentraram na identificação de genes candidatos para a evolução de características em uma variedade de espécies. No entanto, até recentemente, tem sido um desafio validar funcionalmente genes candidatos interessantes. Ferramentas recentemente desenvolvidas para engenharia genética tornam possível manipular genes específicos em uma ampla gama de organismos. A aplicação dessa tecnologia em organismos evolutivamente relevantes permitirá uma visão sem precedentes do papel dos genes candidatos na evolução. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) é uma espécie de peixe com formas que vivem na superfície e em cavernas. Múltiplas linhagens independentes de formas que vivem em cavernas evoluíram de peixes ancestrais da superfície, que são interférteis entre si e com peixes da superfície, permitindo a elucidação da base genética das características das cavernas. A. mexicanus tem sido usado para uma série de estudos evolutivos, incluindo análise de ligação para identificar genes candidatos responsáveis por uma série de características. Assim, A. mexicanus é um sistema ideal para a aplicação da edição do genoma para testar o papel de genes candidatos. Aqui, relatamos um método para usar nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs) para mutar genes na superfície de A. mexicanus. A edição do genoma usando TALENs em A. mexicanus tem sido utilizada para gerar mutações em genes de pigmentação. Essa técnica também pode ser utilizada para avaliar o papel de genes candidatos para uma série de outras características que evoluíram em formas cavernícolas de A. mexicanus.
Introdução
A compreensão da base genética da evolução característica é uma meta pesquisa crítica dos biólogos evolutivos. Um progresso considerável foi feito na identificação de loci subjacentes à evolução dos traços e identificar genes candidatos dentro destes loci (por exemplo 1-3). No entanto, funcionalmente testar o papel destes genes manteve-se como um desafio muitos organismos utilizados para o estudo da evolução de traços não são actualmente tratável geneticamente. O advento das tecnologias de edição genoma aumentou significativamente a manipulabilidade genética de uma larga gama de organismos. Transcrição nucleases-activadores como efectoras (TALENS) e agrupa....
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Protocolo
Todos os procedimentos com animais estavam de acordo com as orientações dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use em Iowa State University e da Universidade de Maryland.
1. TALEN projeto
- Entrada desejada sequência alvo para um site de design TALEN. (Por exemplo: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Entrada escolhida comprimentos de matriz espaçador / repetição.
- Copie a sequência genómica na caixa chamada "seqüência".
- Dentro da aba "fornecer personalizado Spacer / RVD Comprimento....
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Resultados
TALEN injecções par resultar na ligação dos RVDS aos nucleótidos de ADN específicas e, assim, a dimerização dos domínios FokI, resultando em quebras de cadeia dupla 39, que podem ser reparados através da extremidade não-homóloga de união (NHEJ). NHEJ frequentemente introduz erros que resultam em inserções ou deleções (indels). Indels podem ser identificados através da amplificação da região em torno do local alvo TALEN e digestão do fragmento amplificado resultante co.......
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Discussão
Grandes avanços foram feitos nos últimos anos para a compreensão da base genética da evolução dos traços. Embora os genes candidatos subjacentes a evolução de um número de características tem sido identificado, manteve-se um desafio para testar estes genes in vivo, devido à falta de rastreabilidade genética de espécies evolutivamente mais interessantes. Aqui nós relatamos um método para edição genoma em A. mexicanus, espécie usada para estudar a evolução de animais das cavernas. Mapeamento genético est.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Genética, Desenvolvimento e Biologia Celular e Iowa State University e pelo NIH concessão EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner fornecida comentários sobre o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Estação | |||
| Aparelho | |||
| Extrator | |||
| Nanodrop | |||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários< |
| strong>Suprimentos | |||
| Nota: Até onde sabemos, suprimentos de diferentes empresas podem ser usados, salvo indicação | |||
| Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulado) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 em 50% EtOH | Teknova (encomendado através da Fisher) | 50-843-314 | |
| Dicloridrato de Espectinomicina, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicilina (1,000x solução) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, pronto para uso | Thermo Sci Fermentas Inc (encomendado através da Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| placas de Petri | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (encomendado através da Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, não BsaI-HF (conforme descrito no protocolo Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit) |
| BSA | New England Biolabs | fornecido com enzimas de | |
| 10x tampão ligase T4 | Promega (encomendado pela Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (encomendado pela Fisher) | PRM7123 | Outro Taq pode ser usado, mas a reação deve ser ajustada de acordo |
| Kit de ligadura rápida | New England Biolabs (encomendado através da Fisher) | 50-811-728 | Usamos Quick Ligase para todas as reações de montagem TALEN |
| One Shot TOP10 E.coli quimicamente competente | Invitrogen | C4040-06 | Outras células quimicamente competentes ou células competentes caseiras podem ser usadas |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Encomendado através da Fisher) | FERER0451 | |
| Epicentro DNase dependente de ATP seguro para plasmídeo | (encomendado através da Fisher) | NC9046399 | |
| Kit de minipreparação de rotação QIAprep | Qiagen | 27106 | O kit Qiagen deve ser usado para a preparação inicial do plasmídeo (conforme descrito no protocolo Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit) |
| Kit de purificação de PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Agaraose de dissolução rápida | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Encomendado através da Fisher) | PR-R6061 | |
| Kit de Transcrição mMESSAGE mMACHINE T3 | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Corante de Carregamento de Amostra | Ambion (encomendado através da Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (encomendado através da Fisher) | 04-355-32 | |
| Pipetas de Pasteur de Vidro Soda-Cal Descartáveis Fisherbrand | Fisher | 13-678-6B | |
| Capilares de Vidro Padrão | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Pontas de Microcarregador Eppendorf Femtotips para Microinjetor Femtojet | Eppendorf (encomendado através da Fisher) | E5242956003 | |
| Hidróxido de sódio | Fisher | S318-500 | |
| Base Tris | Fisher | BP152-1 |
Referências
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mut....
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Reimpressões e permissões
