Выделение и проточной цитометрии Характеристика мышиных лимфоцитах тонкого кишечника
Summary
There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.
Abstract
Кишечник – которые содержат наибольшее количество иммунных клеток любого органа в теле – постоянно подвергаются чужеродные антигены, как микробного и диетического. Принимая во внимание все большее понимание того, что эти антигены просветные помогают формировать иммунный ответ и что образование иммунных клеток в кишечнике имеет решающее значение для целого ряда системных заболеваний, наблюдается повышенный интерес к характеризующая кишечной иммунной системы. Тем не менее, многие опубликованные протоколы трудным и отнимает много времени. Мы представляем здесь упрощенный протокол для выделения лимфоцитов из тонкой кишки, собственной пластинке слизистой оболочки интраэпителиальной слоя и пейеровых бляшках, что является быстрым, воспроизводимым и не требует трудоемких градиенты перколлом. Хотя протокол фокусируется на тонком кишечнике, он также подходит для анализа толстой кишки. Кроме того, мы отмечаем некоторые аспекты, которые могут потребоваться дополнительные оптимизации в зависимости от конкретной научной Quesции. Такой подход приводит к выделению большого количества жизнеспособных лимфоцитов, которые впоследствии могут быть использованы для анализа потока цитометрии или альтернативные средства определения характеристик.
Introduction
Основная задача тонкой кишки часто считается переваривание и всасывание питательных веществ 1. В то время как эта метаболическая функция явно необходима, в тонкой кишке имеет столь же значительную роль в защите хозяина от постоянной шквал антигенов окружающей среды , найденных в просвете 2. Кишечный тракт отделяет внешний мир (например., Просветные антигены) из внутренней среды организма хозяина с эпителиального слоя , который является только один слой клеток толщиной. Таким образом, малые кишечной иммунной системы имеет непростую задачу балансирования порог на реактивность, позволяя чужеродные антигены из рациона и синантропных микробов, чтобы войти в слизистую оболочку с минимальными, если таковые имеются, иммунный ответ, в то время как монтаж надежный ответ против вторгающихся патогенов и другие "вредные" антигены. Чрезмерное или неуместные иммунные ответы на эти антигены могут привести к патологическим заболеванием (например., Inflammaтори заболевания кишечника, сахарный диабет типа I, множественный склероз) , и его следует избегать 3-6.
В целом, желудочно – кишечный тракт , как полагают, представляют собой самый большой иммунный орган в организме, содержащий более 70% всех секретирующих антитела клеток 7. Тонкой кишки иммунная система состоит из 3 -х основных отсеков – собственная пластинка (LP), в интраэпителиальной слое и пейеровы бляшки (ПФС) – что каждая из них содержит характерную группу лимфоцитов 2. ЛВ – лимфоциты (LPLs) являются в основном TCRαβ + Т – клеток с ~ 20% В – клеток; интраэпителиальной лимфоциты (IELS) содержат очень мало В – клеток с более TCRγδ + Т – клеток , чем TCRαβ + Т – клеток; и СПП, которые являются вторичными лимфоидные органы, встроенные в малой кишечной стенки, содержат ~ 80% В-клеток. Хотя каждая из этих анатомических областей имеет несколько различных функций и онтологические основания, они функционируют в ахarmonized способа, чтобы защитить хозяина от патогенных оскорблений.
Кроме того, растет понимание , что микрофлора является важным фактором , определяющим для развития кишечной иммунной системы, с увеличением признание родственной связи между конкретными микробами и онтогенезе отдельных клеточных клонов 8,9. Кроме того, учитывая , что образование кишечной иммунной системы влияет на иммунную реакцию в анатомически удаленных сайтах (например., Артрит, рассеянный склероз, воспаление легких), стало ясно , что развитие кишечной иммунной системы имеет отношение к более болезненных процессов , чем считалось ранее 10 -12. Таким образом, интерес к количественной оценке кишечной иммунной системы расширилась за пределы хозяин-патоген взаимодействий в настоящее время включают хост-синантропных взаимодействий и патогенеза многих системных заболеваний, а также.
Учитывая изменчивость текущих методов ввыделение кишечных лимфоцитов, метод, который оптимизирован для доходности, жизнеспособности и последовательности, при этом балансируя время, необходимое приобретает все большее значение. Протоколы , которые включают перколлом градиенты по времени и трудоемкими и потенциально более склонны к человеческой ошибки, что приводит к переменной доходности и жизнеспособности 13. При этом мы обеспечиваем оптимизированный протокол для выделения и характеризации лимфоцитов, полученных от всех 3-х небольших кишечных иммунных отсеках. Кроме того, учитывая возрастающий интерес к микробно-индуцированное изменений в иммунной системе слизистой оболочки, мы включаем шаги, которые могут быть использованы для обеспечения горизонтальной передачи микроорганизмов между мышами, чтобы оценить, как эти изменения количественно влияют на кишечную иммунную систему.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем протокол для выделения и проточной цитометрии характеристике небольших-кишечных лимфоцитов, в том числе LPLs, IELS и лимфоцитов в полипропиленов. Для тех, кто заинтересован в оценке того, как изменения в микробиоты влияют на тонкой кишки иммунную систему, мы детализируют п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NKS is supported by NIH award K08 AI108690.
Materials
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| stir bar | VWR | 58949-062 | |
| multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 96-well plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (optional) fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J. Gastrointestinal regulation of food intake. J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
