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Medicine

Sequenciamento profundo imparcial de Vírus RNA de amostras clínicas

Published: July 2, 2016 doi: 10.3791/54117
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Broad Institute of MIT and Harvard, 2Harvard University

Abstract

Aqui destacamos um protocolo de sequenciação de RNA de última geração que permite montagens de novo e chamadas variantes intra-hospedeiras de genomas virais recolhidos a partir de fontes clínicas e biológicas. O método é imparcial e universal; que utiliza iniciadores aleatórios para a síntese de cDNA e não necessita de conhecimento prévio do conteúdo sequência viral. Antes da construção da biblioteca, digestão selectiva baseada-H de ARNase é utilizada para esgotar ARN indesejado - transportador incluindo poli (rA) e ARN ribossomal - a partir da amostra de RNA viral. depleção selectiva melhora tanto a qualidade dos dados e o número de exclusivo lê em bibliotecas RNA sequenciamento viral. Além disso, um passo à base de transposase 'tagmentation' é utilizado no protocolo, uma vez que reduz o tempo global de construção da biblioteca. O protocolo permitiu a sequenciação rápida e profunda de mais de 600 amostras-incluindo Lassa e Ebola vírus coleções de sangue e tecido isola-e é amplamente aplicável a outros estudos de genômica microbiana.

Introduction

geração de sequenciamento próxima de vírus a partir de fontes clínicas pode informar transmissão e epidemiologia das infecções, bem como ajuda o apoio romance de diagnóstico, vacinas e desenvolvimento terapêutico. síntese de cDNA utilizando iniciadores aleatórios permitiu a detecção e montagem de genomas de divergente, co-infectante ou mesmo novos vírus 1,2. Tal como acontece com outros métodos imparciais, contaminantes indesejados ocupam muitos sequenciamento lê e impactar negativamente os resultados de sequenciamento. Host e poli RNA transportador (RA) são contaminantes presentes em muitas colecções de amostras virais existentes.

O protocolo descreve de forma eficiente e rentável de genomas virais de ARN sequenciamento profundas com base em preconceitos RNA-seq total. O método utiliza uma depleção selectiva passo 3 ARNase H para remover ribossomal hospedeiro indesejado e ARN transportador. Depleção selectiva enriquece para conteúdo viral (Figura 1) e melhora a qualidade global dos dados de sequenciação(Figura 2) a partir de amostras clínicas. Além disso, tagmentation é aplicada ao protocolo, uma vez que reduz significativamente o tempo de construção da biblioteca. Estes métodos têm sido usados ​​para gerar rapidamente grandes conjuntos de dados do Ebola e Lassa genomas de vírus 2,4,5 e pode ser usado para estudar uma grande variedade de vírus de ARN. Por último, a abordagem não está limitado a amostras humanas; a utilidade da depleção selectiva foi demonstrada em amostras de tecidos obtidas de roedores de Lassa-infectadas e modelos de doença de primatas não humanos 5,6.

figura 1
Figura 1. Total de RNA conteúdo reflete Enriquecimento de conteúdo Vírus Lassa Usando Selective esgotamento. A partir conteúdo global (entrada RNA) e enriquecimento do vírus original Lassa (LasV) lê (teor Library) sobre esgotamento rRNA de nove isolados clínicos diferentes. Esta figura foi modificado a partir de 6 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Maior Qualidade Sequencing Após portador RNA Esgotamento. Qualidades de base medianos por ciclo de sequenciação de poli (rA) -contaminated bibliotecas de vírus de Lassa (vermelho) e controle (sem portadora observado na biblioteca, preto) do relatório de QC 13. Tanto ler 1 e leia 2 de final emparelhado lê são mesclados no arquivo BAM biblioteca e os índices de qualidade são mostrados em cada base. Este valor foi modificado a partir do 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O detalhes do protocolo de construção RNA-seq viral de bibliotecas directamente a partir extraídoARN recolhido a partir de amostras clínicas e biológicas. Para garantir a segurança pessoal, todas as amostras de soro, plasma e tecido virais devem ser inactivado em tampões apropriados antes da extração do RNA. Em alguns kits de inactivação e de extracção, poli transportador ARN (AR) é incluído; este vai ser removida durante o passo inicial depleção selectiva de RNase H. Com base na recuperação completa, a concentração esperada de ARN transportador é de 100 ng / ul. No protocolo, 110 ng / ul de oligo dT de ARN (concentração transportador 1,1x) é usada para depleção. Se poli (rA) portadora não está presente na amostra, em seguida, oligo (dT) não deve ser adicionado antes do esgotamento.

O seguinte protocolo foi concebido para 24 reacções de PCR em formato de placa (até 250 ul de volume). Uma versão anterior deste protocolo foi relatada em Matranga, et al. 6.

Protocol

declaração de ética: pacientes febre de Lassa foram recrutados para este estudo usando protocolos aprovados por comitês de assuntos humanos na Universidade de Tulane, Universidade de Harvard, o Instituto Broad, Irrua Specialist Hospital de Ensino (ISTH), Hospital Governo Kenema (KGH), Oyo Ministério da Saúde do Estado, Ibadan , Nigéria e Serra Leoa Ministério da Saúde. Todos os pacientes foram tratados com um padrão semelhante de cuidado e receberam a droga ribavirina, com ou sem eles decidiram participar do estudo. Para pacientes com febre de Lassa (LF), o tratamento com Ribavirina seguiu as diretrizes recomendadas atualmente e foi geralmente oferecido tão logo LF foi fortemente suspeito.

Devido à grave surto de doença do vírus Ebola (EVD), os pacientes não poderiam ser consentido através de nossos protocolos padrão. Em vez disso utilização de amostras clínicas excesso de pacientes EVD foi avaliado e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional na Serra Leoa e na Universidade de Harvard. o Office do Comité de Serra Leoa Ética e de análise científica, a Serra Leoa Ministério da Saúde e Saneamento, e ao Comité de Harvard sobre o Uso de Seres Humanos ter concedido uma dispensa do consentimento para sequenciar e fazer sequências virais disponíveis publicamente obtidos a partir de amostras de pacientes e de contato coletadas durante o surto de Ebola em Serra Leoa. Esses órgãos também concedeu uso de dados clínicos e epidemiológicos para amostras identificou-de coletados de todos os pacientes suspeitos EVD recebem cuidados durante a resposta ao surto. A Serra Leoa Ministério da Saúde e Saneamento aprovou também as transferências de não-infecciosas amostras, não-biológicos de Serra Leoa para Broad Institute e da Universidade de Harvard para estudos genômicos de amostras de surto.

1. DNase-tratamento do RNA da amostra (até 55 jil de extracção de ARN total, ~ 4 h)

  1. Defina-se a reacção de ADNase numa placa de 96 poços de PCR em gelo numa cabine de segurança biológica tal como descrito na Tabela 1
  2. Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min.
  3. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
  4. Limpeza usando fase sólida reversível imobilização (SPRI) grânulos de ARN.
    1. grânulos de RNA aquecimento à temperatura ambiente durante 30 minutos.
    2. Agitar suavemente garrafa esferas de RNA para voltar a suspender as partículas magnéticas que podem se instalaram. Adicionar volume de 1,8x (126 ul) de grânulos de ARN para ARN tratado com ADNase (70 mL), mistura com uma pipeta de 10 vezes e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (o volume total no poço, 196 uL).
    3. Coloque a mistura de na estação magnético. Aguarde até que a solução para limpar (5-10 min).
    4. Remova a solução apagada, enquanto na estação com uma pipeta e descarte. Enquanto na estação, lavar grânulos através da cobertura de sedimento com etanol a 70% e incubar durante 1 min. Remover o etanol com pipeta e descarte. Repetir para um total de duas lavagens.
      Nota: O uso et precisamente 70% preparado de frescohanol é crítica, como uma percentagem mais elevada resultará na lavagem ineficiente de moléculas menores em tamanho, enquanto que <70% de etanol poderia causar a perda de amostra 7.
    5. Mantenha placa na estação e deixar em aberto a secar ao ar. Nota: Certifique-se de permitir que as contas para secar completamente até contas de começar a rachar.
    6. Adicionar 55 ul de água isenta de nuclease para a placa para eluir o ARN. Retire a placa da estação para misturar os grânulos e água pipetando cuidadosamente. Nota: Em alternativa, usar menos água (≤ 10 uL), a fim de concentrar o ARN total.
    7. Coloque placa de volta na estação. Aguardar até que a solução limpa para transferir por pipeta para novo tubo com tampa de rosca para o armazenamento a longo prazo (-80 ° C). Coloque 5 ul de ARN na nova placa de 96 poços de PCR para a depleção (passo. 2.4).
    8. Opcional:. Excepto e dilui-se 1 ml em 19 ul de água (01:20) para qRT-PCR de rRNA (por exemplo, 18S, 28S rRNA) (Tabela 2) e os marcadores virais 5 </ Li>

2. depleção selectiva de ribossomal e Carrier ARN a partir de ARN viral da amostra (~ 4 h)

  1. Adicione hibridação 5x e 10x tampões de reacção de RNase H, e água isenta de nuclease com o transportador linear de acrilamida, tal como descrito na Tabela 1.
  2. Defina-se a reacção de hibridação através da combinação de ARN com oligos de depleção de rRNA (Tabela 3) e o oligo (dT) em gelo numa placa de 96 poços de PCR como descrito na Tabela 1.
    Nota: A mistura principal pode ser preparado. 50 femtogramas (fg) de um RNA sintético único (ERCCs 8) podem ser adicionados para acompanhar tanto o processo de sequenciamento viral e potencial índice de ler a contaminação cruzada.
    1. Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min.
      Incubar a 95 ° C durante 2 min, rampa lento para 45 ° C a -0,1 ° C por segundo. Pause o termociclador a 45 ° C.
  3. Configurar RNase H mistura de reacção em gelo como descreverd na Tabela 1, em seguida, pré-aquecer a 45 ° C durante 2 min. Nota: A mistura principal pode ser preparado.
    1. Adicionar a mistura de RNase H de pré-aqueceu-se a reacção de hibridação em placa, mantendo a placa no termociclador a 45 ° C.
    2. Misture bem por pipetagem suave 6 - 8 vezes. Incubar a 45 ° C durante mais 30 min. Coloque no gelo.
  4. Defina-se a mistura de reacção em gelo ADNase tal como descrito na Tabela 1 Nota:. A mistura principal pode ser preparado.
    1. Adicionar à reacção de RNase H em placa, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
    2. Pare ADNase reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5M. Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min.
  5. Cleanup usando esferas de RNA (ver passo 1.3), utilizando um volume de 1,8x (144 mL) esferas. Eluir em 11 mL de água livre de nuclease. Nota: Para armazenamento a frio seguro, armazenamento esgotada RNA amostras a -80 ° C O / N.

3. Síntese de cDNA (~ 6 h)

  1. Mistura rRNA / ARN empobrecido-transportador com iniciadores aleatórios sobre gelo numa placa de 96 poços de PCR como descrito na Tabela 1, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min.
    1. Aquecer a mistura a 70 ° C durante 10 minutos num termociclador. Imediatamente após a desnaturação pelo calor, colocar o ARN em gelo durante 1-5 minutos. Não permitir que o ARN em repouso (mesmo em gelo) durante mais de 5 minutos antes da reacção da primeira cadeia.
  2. Defina-se da primeira cadeia mistura de reacção de síntese em gelo tal como descrito na Tabela 1.
    Nota: Um mestre de mistura pode ser preparada.
    1. Adicionar ao ARN / mistura de iniciadores aleatórios em placa, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. Incubar a 22 - 25 ° C durante 10 min.
    2. Incubar a 55 ° C numa incubadora de ar durante 60 min. Colocar a placa em gelo para terminar a reacção. NãoE: O uso de uma incubadora de ar é recomendado para criar o aquecimento gradual da primeira cadeia de reacção durante o qual o recozimento iniciadores e a primeira cadeia começa a alongar-se.
  3. Defina-se da segunda cadeia mistura de reacção de síntese em gelo tal como descrito na Tabela 1.
    Nota: Um mestre de mistura pode ser preparada.
    1. Adicionar à primeira cadeia de síntese de reacção na placa, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. Incubar durante 2 horas a 16 ° C (manter a tampa a 25 ° C). Não permitir que a temperatura subisse acima de 16 ° C.
    2. Colocar a placa sobre gelo, em seguida, inactivar reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5 M, mistura suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min.
  4. Limpeza com contas de DNA (veja o passo 1.3 para o protocolo) usando volume de 1,8x (153 mL) de contas. Eluir em 9 ul de tampão de eluição (EB). Salve 1 ul para quantificação. Use de 1 ng de cDNA para subsequepassos NT. Se a concentração de cDNA é muito baixo para detectar, utilize 4 l de cDNA para tagmentation (veja o passo 4.1).
  5. Para o armazenamento a frio, armazene ADNc de cadeia dupla a 4 ° CO / N ou -20 ° C para armazenamento a longo prazo.

4. Biblioteca de Preparação - Construção de ADN da biblioteca (~ 4 h)

  1. Transferência 4 uL de ADNc a uma placa de 96 poços e guardar o restante ADNc para uma segunda tentativa, se necessário.
  2. Defina-se a reacção tagmentation em gelo tal como descrito na Tabela 1.
    Nota: Um mestre de mistura pode ser preparada. Para reduzir o fundo e o custo total, o volume total da reacção tagmentation é reduzida de 20 a 10 ul. Como ADNc é o factor limitante, a quantidade de ATM (ou seja, transposome) usado na reacção é também reduzida para diminuir o número de sítios de integração.
    1. Adicionar mistura tagmentation de ADNc na placa, de vórtice suave e completamente e centrifugar a 280 xg (à TA) durante 1 min.Incubar a 55 ° C durante 5 min, manter a 10 ° C.
    2. Uma vez a 10 ° C, adicionar imediatamente com 2,5 mL de tampão de Neutralizar Tagment (NT) para terminar a reacção. Misturar por pipetagem cima e para baixo, em seguida, centrifugar a 280 xg (à temperatura ambiente) durante 1 min.
    3. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
  3. Defina-se a amplificação por PCR da reacção em gelo tal como descrito na Tabela 1.
    1. Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min.
    2. Executar PCR no termociclador utilizando as condições descritas na Tabela 1.
      Nota: 12 ciclos de PCR são sugeridos para 1 ng de ADNc tagmented; No entanto, as amostras clínicas virais têm frequentemente quantidades indetectáveis ​​de ADNc. Para pequenas quantidades de cDNA (<1 ng), utilizar até 18 ciclos de PCR para criar biblioteca suficiente para sequenciamento.
  4. preparação Biblioteca - limpeza e de partilha para a sequenciação
    1. Trazer amostra até 50 ul com EB.
    2. Limpeza comgrânulos de DNA (veja o passo 1.3 para o protocolo), utilizando o volume de 0,6x (30 ul) grânulos. Eluir em 15 mL EB.
    3. Determinar a concentração de biblioteca (Figura 3) através da realização de análise região (150 a 1000 pb), utilizando o software Bioanalyzer 9, excluindo dímeros de iniciadores (~ 120 pb) a partir de análise região. Nota: Em alternativa, qPCR pode ser utilizado para quantificar as bibliotecas 10.
    4. bibliotecas piscina na concentração molar menor de 1 nM ou superior. Se biblioteca é inferior a 1 nM, adicionar um pequeno volume de biblioteca para piscina (~ 1x o volume de outras bibliotecas) para capturar informação de sequência a partir destas bibliotecas.
    5. piscina de limpeza com contas de DNA 0,7x, conforme descrito acima (veja o passo 2). Eluir em 15 mL EB. Nota: O volume de grânulos irá depender do volume final da piscina.
    6. Analisar piscina 9. Determinar a concentração molar através da realização de análise região (150 a 1000 pb) 9. Nota: Em alternativa, qPCR pode ser utilizado para quantificar piscina biblioteca 10 </ Sup>.
    7. Carga sequenciador na concentração biblioteca 22:00 para gerar 101 pb, emparelhado-end lê com dual código de barras lê 11.

Figura 3
Figura 3. bibliotecas construídas a partir de vírus Ebola amostras clínicas. Image Gel de 4 de representante do vírus Ebola bibliotecas (EBOV). Regiões de biblioteca e de primers dímeros são apresentados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Representative Results

O protocolo descrito permite a geração de sequenciamento de alta qualidade lê a partir de amostras de RNA viral baixa de entrada enquanto enriquece para conteúdo viral único. Como mostrado na Figura 1, o protocolo enriquecido conteúdo único vírus de Lassa, pelo menos, cinco vezes em todas as amostras (em comparação com os controlos não-empobrecido) com, pelo menos, um milhão de cópias de rRNA 18S (~ 100 pg de RNA total). Do mesmo modo, o sucesso de sequenciação também correlacionada com a quantidade de vírus numa dada amostra. Usando qRT-PCR como um substituto para a quantidade viral, as amostras que continham ~ 1.000 ou mais cópias de genoma virais mais frequentemente criados conjuntos completos (dados não mostrados). Além disso, a depleção de poli transportadora (Ra) reduz sequências Homopolímero de A e T, em bibliotecas, resultando em preparações mais limpas e assegurar uma melhor qualidade de sequenciação lê (Figura 2). bibliotecas finais de amostras clínicas viral baixa de entrada, muitas vezes têm um amplo comprimento de fragmentos de 150 a 1000 pb(Figura 3).

Após sequenciação, para reduzir erros de identificação da amostra e crosstalk entre as bibliotecas dentro de uma piscina de 12, único índice lê com uma pontuação de 25 (Q25) a qualidade de base e assegurar a inexistência de incompatibilidades são mantidos durante o processo de desmultiplexagem. Genomas virais são montados utilizando um oleoduto bioinformática específico para vírus divergentes 2,4-6. Estas ferramentas estão disponíveis em https://github.com/broadinstitute/viral-ngs ou através de plataformas em nuvem comerciais 4.

Passo 1.1: reacção ADNase
Reagente Volume por reacção de (l)
tampão 10x DNase 7
água livre de nuclease 6
ARN virai extraído 55
ADNase (2 U / & #181; l) 2
Volume total 70
Passo 2.1: 5x tampão de hibridação
Reagente Volume para 1 ml (mL)
5 M de NaCl 200
M de Tris-HCl 1 M (pH 7,4) 500
água livre de nuclease 300
Volume total 1.000
Passo 2.1: 10x tampão de reacção de RNase H
Reagente Volume para 1 ml (mL)
5 M de NaCl 200
M de Tris-HCl 1 M (pH 7,5) 500
1 M de MgCl2 200
água livre de nuclease 500
Volume total 1.000
Passo 2.1: Água wacrilamida linear om
Reagente Volume para 1 ml de tampão (pi)
água livre de nuclease 992
acrilamida Linear (5 mg / ml) 8
Volume total 1.000
Passo 2.2: reacção de hibridação para a depleção selectiva
Reagente Volume por reacção de (l)
Tampão de Hibridização de 5x 2
-rRNA depleção mistura de oligo (100 uM) 1,22
Oligo (d) t (550 ng / ul) 1
tratado com ADNase ARN total Até 5
Spike-in RNA (Isto é opcional) 0,5
Água (com acrilamida linear) levar até um total de 10
volu totalmim 10
Passo 2.3: RNase H reacção de depleção selectiva
Reagente Volume por reacção de (l)
Tampão de Reacção 10x ARNase H 2
Água (com acrilamida linear) 5
Termoestável ARNase H (5 U / uL) 3
Volume total 10
Passo 2.4: DNase pós reacção de depleção selectiva
Reagente Volume por reacção de (l)
Tampão de ADNase 10x 7,5
Água (com acrilamida linear) 44,5
inibidor de ARNase (20 U / ul) 1
livre de RNase DNase I (2,72 U / uL) 2 O volume total (com reacção de RNase H) 75
Passo 3.1: síntese de ADNc, hibridação do iniciador aleatório
Reagente Volume por reacção de (l)
rRNA ARN / empobrecido-transportador 10
3 ug de iniciador aleatório 1
Volume total 11
Passo 3.2: A primeira cadeia de reacção de síntese de ADNc
Reagente Volume (uL)
5x primeira cadeia Tampão de Reacção 4
0,1 M de DTT 2
de mistura de dNTP 10 mM 1
inibidor de ARNase (20 U / ul) 1
transcriptase reversa (adicione passado) 1
O volume total (com o ARN acima) </ Td> 20
Passo 3.3: segunda cadeia reação de síntese de cDNA
Reagente Volume (uL)
água livre de RNase 43
10x Tampão de reacção da segunda cadeia 8
de mistura de dNTP 10 mM 3
E. coli ADN-ligase (10 U / ul) 1
ADN de E. coli polimerase I (10 U / ul) 4
E. coli RNase H (2 U / ul) 1
O volume total (com 1º reacção vertente) 80
Passo 4.2: reacção Tagmentation
Reagente Volume (uL)
Amplicon Mix Tagment (ATM) 1
Tampão de DNA Tagment (TD) 5
O volume total (com ADNc) 10
Passo 4.3: Biblioteca de reacção de PCR
Reagente Volume (uL)
PCR Master Mix (NPM) 7,5
Índice 1 primário (i7) 2.5
Índice 2 de primer (i5) 2.5
O volume total (com tagmented ADNc) 25
Passo 4.3.2: As condições de PCR da biblioteca
72 ° C, 3 min
95 ° C, 30 seg
-se a 18 ciclos de 10 seg a 95 ° C, 30 seg a 55 ° C, 30 seg a 72 ° C
72 ° C, 5 min
10 ° C, sempre

Tabela 1:. Reacção set-up e buffers Passo-a-passo tabelas com conteúdo de todos os buffers e misturas de reacção.

Tabela 2: qRT-PCR Primers Sequências de iniciadores utilizados para medir host (18S rRNA) e viral conteúdo (Ebola e Lassa).. 'KGH' é Hospital Kenema Governo da Serra Leoa, onde os iniciadores de Ebola foram testados 2. 'Kulesh' é o investigador que projetou o conjunto de primers 14.

Tabela 3: RNA ribossomal (rRNA) Exaustão Oligos 195 50-nucleotide longas sequências complementares para rRNA humano para a etapa depleção selectiva 6.. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Discussion

A abordagem descrita permite robusta, universal sequenciamento, rápido e foi usado para sequenciar o vírus Ebola durante a 2,4 2.014 surto. Ao acoplar a depleção selectiva de síntese de ADNc e com a construção da biblioteca tagmentation, o tempo total de processo foi reduzida em aproximadamente 2 dias de métodos adaptador de ligação anteriores. Mais recentemente, este protocolo foi empregado por colaboradores internacionais e outros com grande sucesso 15,16 e será implantado em laboratórios na África Ocidental para apoiar estudos de investigação genómica baseada em locais e diagnósticos 17.

O protocolo aqui descrito utiliza iniciadores aleatórios para preparar bibliotecas de ADNc para ARN-SEQ virais. Ao contrário de abordagens de ARN-virais SEQ anteriores, que não requer um conhecimento a priori de dados de sequências ou design elaborado e demorado de iniciadores para um vírus ou subtipo específico. O método pode ser aplicado a qualquer amostra de ARN viral. Por exemplo, ele foi usado para gerar conteúdo viral de ambos Ebolae amostras de Lassa 6. O protocolo também pode ser utilizado para transcriptómica hospedeiro, projectos de sequenciação e detecção de agentes patogénicos metagenomic 1.

Uma etapa fundamental do protocolo é a digestão alvo ARNase H, um de elevado rendimento, o método de baixo custo para a remoção indesejada transportadora e ARN do hospedeiro a partir de amostras virais. O passo de depleção selectiva do protocolo utiliza muitos componentes e requer habilidade e exactidão. tempo e cuidado extra deve ser tomado durante a configuração inicial.

Como a maioria das amostras de soro e plasma clínicos muitas vezes têm muito pouco material de ácido nucleico, contaminação e perda de amostra são comuns. Para evitar esses problemas, cuidados especiais devem ser tomados ao usar este protocolo. Primeiro, o ARN é altamente susceptível à degradação; portanto, todas as áreas devem estar limpas e livres de nucleases. Em segundo lugar, para identificar amostras adequadas para utilização no presente protocolo, ensaios de qRT-PCR para ambos ARN do hospedeiro e vírus deve ser utilizado para quantificação 5,6 (isto é, geração de dados suficientes para a montagem virai completo) correlacionaram-se com as amostras que continham pelo menos 100 pg de RNA total e 1.000 cópias do vírus. Em terceiro lugar, a exposição a fontes ambientais de ácidos nucleicos devem ser evitados. O protocolo descrito aqui é feito de uma cabine de segurança biológica para precauções de segurança e para limitar contaminantes ambientais. Além disso, o nosso grupo e outros têm notado que as enzimas comerciais, podem ser outra fonte de ácidos nucleicos contaminantes bacterianos em amostras de entrada baixa 6,18. O uso de um espaço de trabalho limpo (por exemplo, capô PCR, cabine de segurança biológica) e controlos negativos (por exemplo, água ou tampão) vai ajudar a aliviar e controlar a contaminação, respectivamente. Para amostras com <100 pg de ARN total, apenas de poli (rA) RNA transportador, não ARNr, deve ser esgotado para assegurar resultados de sequenciação de alta qualidade, evitando a perda de material. por muitoamostras de entrada baixas, métodos de amplificação de cDNA pode ser mais adequado 19, apesar de poli (rA) transportador deve ser removido antes da síntese de ADNc.

A depleção de acolhimento rRNA enriquece para conteúdo viral em bibliotecas de sequenciação e é aplicável a diferentes colecções de amostras incluindo plasma ou soro, e vários tipos de tecidos de roedores e primatas não-humanos 5,6. Em organismos não humanos, as leituras de alinhamento 28S rRNA permaneceu após esgotamento, sugerindo 28S rRNA é menos conservada entre humanos e outras espécies de 6,20. Ao utilizar este método com estirpes não-humanos, pode ser necessário para completar, com oligos de ADN complementares às sequências de rRNA 3,21 divergentes do hospedeiro específico.

Como o protocolo é imparcial, viral lê podem representar apenas uma pequena fração do conteúdo total de biblioteca. Embora rRNA é a espécie mais abundante de ARN do hospedeiro e apenas uma pequena percentagem de rRNA lê (0; 1%) são encontrados após a depleção selectiva, todos os outros ARN do hospedeiro (por exemplo, ARNm) permanecerá depois de exaustão e pode ser responsável por muitos sequenciação lê a partir da amostra. Portanto "oversampling" (ou seja, oversequencing) bibliotecas individuais é necessária, a fim de ter uma cobertura suficiente para chamadas de montagem e de variantes virais. Para os nossos estudos, tentamos sequência de ~ 20 milhões de leituras por amostra ter profundidade suficiente para a análise de variantes genômica e associado viral, bem como conteúdo metagenomic 2,5. Para os estudos de descoberta metagenomic e organismos patogénicos, é importante notar que a contaminação de ADN do hospedeiro é removido por digestão de DNase. Por conseguinte, os vírus e outros agentes patogénicos que contêm genomas de ADN podem ser perdidas durante o processo, no entanto intermediários de RNA pode ainda ser sequenciado.

Materials

Nome oligo Sequência (5 'para 3')
Ebola KGH FW GTCGTTCCAACAATCGAGCG
Ebola KGH RV CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT
Ebola kulesh FW TCTGACATGGATTACCACAAGATC
Ebola kulesh RV GGATGACTCTTTGCCGAACAATC
Lassa SL FW GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC
Lassa SL RV AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A
18S rRNA FW TCCTTTAACGAGGATCCATTGG
18S rRNA RV CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT
Name Company Catalog Number Comments
96-well PCR Plates VWR 47743-953
Strips of Eight Caps VWR 47745-512
Nuclease-free water Ambion AM9937 50 ml bottle
TURBO DNase Ambion AM2238 post RNA extraction step, 2 U/µl, buffer included
PCR cycler any PCR cyclers 
Agencourt RNAClean XP SPRI beads  Beckman Coulter Genomics A63987 beads for RNA cleanup
Real Time qPCR system any system
DynaMag-96 Side Skirted Magnet Invitrogen 12027
70% Ethanol prepare fresh
qRT-PCR primers IDT DNA see Table 2
5 M NaCl  Ambion AM9760G
1 M Tris-HCl pH 7.4  Sigma T2663-1L
1 M Tris-HCl pH 7.5  Invitrogen 15567-027
1 M MgCl2  Ambion AM9530G
Linear acrylamide  Ambion  AM9520
DNA oligos covering entire rRNA region IDT DNA see Table 3, order lab-ready at 100 µM
Oligo (dT) IDT DNA 40 nt long, desalted
Hybridase Thermostable RNase H  Epicentre H39100
RNase-free DNase Kit  Qiagen 79254 post selective depletion step
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Random Primers  Invitrogen 48190-011 mostly hexamers
10 mM dNTP mix New England Biolabs N0447L
SuperScript III Reverse Transcriptase  Invitrogen 18080-093 with first-strand buffer, DTT
Air Incubator any air incubator cyclers 
NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer New England Biolabs B6117S 10x
E. coli DNA Ligase New England Biolabs M0205L 10 U/μl
E. coli DNA Polymerase I  New England Biolabs M0209L 10 U/μl
E. coli RNase H New England Biolabs M0297L 2 U/μl
0.5 M EDTA Ambion AM9261
Agencourt AMPure XP SPRI beads Beckman Coulter Genomics A63881 beads for DNA cleanup
Elution Buffer  Qiagen 10 mM Tris HCl, pH 8.5
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit  Invitrogen Q32854
Qubit fluorometer  Invitrogen Q32857
Nextera XT DNA Sample Prep Kit  Illumina FC-131-1096
Nextera XT DNA Index Kit  Illumina FC-131-1001
Tapestation 2200 Agilent G2965AA
High Sensitivity D1000 reagents Agilent 5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584
BioAnalyzer 2100  Agilent G2939AA
High Sensitivity DNA reagents Agilent 5067-4626
Library Quantification Complete kit (Universal) Kapa Biosystems KK4824 alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification

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References

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Matranga, C. B., Gladden-Young, A., Qu, J., Winnicki, S., Nosamiefan, D., Levin, J. Z., Sabeti, P. C. Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples. J. Vis. Exp. (113), e54117, doi:10.3791/54117 (2016).

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