Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Uvildige Deep Sekventering af RNA vira fra kliniske prøver

Published: July 2, 2016 doi: 10.3791/54117
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Broad Institute of MIT and Harvard, 2Harvard University

Abstract

Her skitserer vi en næste-generations-RNA sekventering protokol, der gør det muligt for de novo forsamlinger og intra-vært variant opkald af virale genomer indsamlet fra kliniske og biologiske kilder. Metoden er saglig og universel; det bruger vilkårlige primere til cDNA-syntese og kræver ingen forudgående kendskab til den virale indhold sekvens. Før bibliotek konstruktion er selektiv RNase H-baserede fordøjelse anvendt til at depletere uønskede RNA - herunder poly (rA) bærer og ribosomalt RNA - fra det virale RNA-prøve. Selektiv udtynding forbedrer både kvaliteten af ​​data og antallet af unikke læser i virale RNA sekventering biblioteker. Desuden er en transposasen-baserede "tagmentation 'trin, der anvendes i protokollen, da det reducerer den samlede bibliotek byggetid. Protokollen har muliggjort hurtig dyb sekventering af over 600 Lassa og Ebola virus prøver, inklusive samlinger fra både blod og væv isolerer-og er bredt anvendelig til andre mikrobielle genomics studier.

Introduction

Næste generation sekventering af virus fra kliniske kilder kan informere transmission og epidemiologi af infektioner, samt hjælpe support roman diagnostik, vaccine og terapeutisk udvikling. cDNA syntese ved hjælp af tilfældige primere har tilladt påvisning og samling af genomer fra divergerende, co-inficerende eller endda nye vira 1,2. Som med andre uvildige metoder, uønskede forureninger besætte mange sekventering læser og negativ indflydelse sekventering resultater. Vært og poly (rA) carrier-RNA er forurenende stoffer i mange eksisterende virale prøve samlinger.

Protokollen beskriver en effektiv og omkostningseffektiv måde af dybe sekventering RNA virus genomer baseret på uvildig total RNA-seq. Metoden udnytter en RNase H selektiv udtynding trin 3 for at fjerne uønsket vært ribosomalt og carrier-RNA. Selektiv depletion beriger for viral indhold (figur 1) og forbedrer den samlede kvalitet af sekventering data(Figur 2) fra kliniske prøver. Desuden er tagmentation anvendes til protokollen, da det reducerer bibliotek byggetid. Disse fremgangsmåder er blevet anvendt til hurtigt frembringe store datasæt af Ebola og Lassa virus genomer 2,4,5 og kan bruges til at studere en bred vifte af RNA-vira. Endelig er tilgang ikke begrænset til humane prøver; anvendeligheden af selektive depletering blev demonstreret på vævsprøver indsamlet fra Lassa-inficerede gnavere og ikke-humane primat sygdomsmodeller 5,6.

figur 1
Figur 1. Total RNA indhold Afspejler Berigelse af Lassa virus Content Brug Selective Udtømmelse. Starter overordnede indhold (RNA input) og berigelse af unikke Lassa virus (LASV) læser (Bibliotek indhold) ved rRNA udtømning fra ni forskellige kliniske isolater. Dette tal er blevet ændret fra 6 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Højere kvalitet sekventering Efter Carrier RNA Udtømmelse. Median base-kvaliteter pr sekventering cyklus af poly (rA) -contaminated Lassa virus biblioteker (rød) og kontrol (ingen observeret i biblioteket luftfartsselskab, sort) fra QC rapport 13. Både læse 1 og læs 2 af parret ende læser flettes i biblioteket BAM-filen og de kvalitetskrav score er vist på hver base. Dette tal er blevet ændret fra 6. Klik her for at se en større version af dette tal.

Den virale RNA-seq protokol detaljer konstruktion af biblioteker direkte fra udvundetRNA indsamlet fra kliniske og biologiske prøver. For at sikre personlig sikkerhed bør alle virale serum, plasma og vævsprøver inaktiveres i passende buffere før RNA ekstraktion. I nogle inaktivering og udvinding kits, er luftfartsselskabet poly (rA) RNA inkluderet; dette vil blive fjernet i den indledende RNase H selektiv depletion trin. Baseret på fuldstændig helbredelse, den forventede koncentration af carrier-RNA er 100 ng / pl. I protokollen, er 110 ng / ul oligo dT RNA (1,1 x carrier koncentration) bruges til udtynding. Hvis poly (rA) luftfartsselskabet ikke er til stede i prøven, må ikke tilsættes derefter oligo (dT) før udtømning.

Følgende protokol er beregnet til 24 reaktioner i PCR-plade-format (op til 250 pi volumen). En tidligere version af denne protokol blev rapporteret i Matranga, et al. 6..

Protocol

Etik erklæring: Lassa feber patienter blev rekrutteret til denne undersøgelse ved hjælp protokoller godkendt af forsøgspersoner udvalg på Tulane University, Harvard University, Broad Institute, Irrua Specialist Teaching Hospital (ISTH), Kenema Regeringen Hospital (KGH), Oyo staten Sundhedsministeriet, Ibadan , Nigeria og Sierra Leone sundhedsministerium. Alle patienter blev behandlet med en tilsvarende standard for behandling og blev tilbudt lægemidlet Ribavirin, uanset om de har besluttet at deltage i undersøgelsen. For Lassa feber (LF) patienter, behandling med Ribavirin fulgte de aktuelt anbefalede retningslinjer og var generelt tilbydes så snart LF var stærkt mistænkt.

På grund af den alvorlige udbrud for ebola (EVD), kunne patienterne ikke samtykket gennem vores standard protokoller. I stedet brug af kliniske overskydende prøver fra EVD patienter blev evalueret og godkendt af Institutional Review Boards i Sierra Leone og på Harvard University. Den Office af Sierra Leones Etik og Videnskabelige Komité, Sierra Leone Ministeriet for Sundhed og sanitet samt Harvard Udvalget om brug af personmotiver har givet afkald på samtykke til sekvens og gøre offentligt tilgængelige virale sekvenser opnået fra patient og kontakt prøver indsamlet under Ebola udbrud i Sierra Leone. Disse organer gives også brug af kliniske og epidemiologiske data for de-identificerede prøver indsamlet fra alle formodede EVD patienter, som fik pleje under udbruddet respons. Sierra Leone Sundhedsministeriet og sanitet godkendte også overførsler af ikke-smitsomme, ikke-biologiske prøver fra Sierra Leone til de overordnede Institute og Harvard University for genomiske studier af udbrud prøver.

1. DNase-behandling af prøve-RNA (op til 55 pi Ekstraherede Totalt RNA, ~ 4 timer)

  1. Opsætning af DNase reaktion i en 96-brønds PCR-plade på is i et bio kabinet som beskrevet i tabel 1
  2. Vortex forsigtigt og grundigt, centrifugeres ved 280 xg ved stuetemperatur i 1 min.
  3. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
  4. Oprydning anvendelse af RNA fastfase Vendbar Immobilisering (SPRI) perler.
    1. Varm RNA perler til stuetemperatur i 30 minutter.
    2. Ryst forsigtigt RNA perler flaske for at resuspendere eventuelle magnetiske partikler, der kan have afregnet. Tilføj 1,8 x volumen (126 ul) af RNA perler til DNase-behandlet RNA (70 pi), blandes med pipette 10 gange og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur (samlet volumen på godt, 196 pi).
    3. Anbring blandingen på den magnetiske station. Vent på, at løsningen for at rydde (5 - 10 min).
    4. Fjern ryddet løsning, mens på stationen med pipette og udsmid. Mens på stationen, vaske perlerne ved at dække pellet med 70% ethanol og inkuberes i 1 min. Fjern ethanol med pipette og udsmid. Gentag for i alt to vaske.
      Bemærk: Brug af præcist 70% frisk fremstillet ethanol er kritisk, da en højere procentdel vil resultere i ineffektiv vask af mindre størrelse molekyler, hvorimod <70% ethanol kan forårsage tab af prøve 7.
    5. Hold plade på stationen og efterlade åben lufttørre. Bemærk: Sørg for at give perlerne til at tørre helt indtil perler begynder at knække.
    6. Tilføj 55 pi nuclease-frit vand til pladen til eluering RNA. Fjern pladen fra stationen at blande perlerne og vand ved pipettering grundigt. Bemærkning: Alternativt bruge mindre vand (≤ 10 pi) for at koncentrere det totale RNA.
    7. Placer pladen tilbage på stationen. Vent løsning rydder at overføre med pipette til nye skruelåg rør til langtidsopbevaring (-80 ° C). Placer 5 pi RNA i nye 96-brønds PCR-plade for depletion (trin. 2.4).
    8. Valgfrit:. Gem og fortyndes 1 pi i 19 pi vand (1:20) for QRT-PCR af rRNA (f.eks 18S, 28S rRNA) (tabel 2) og virale markører 5 </ Li>

2. Selektiv Udtømning af Ribosomal og Carrier RNA fra Viral RNA-prøve (~ 4 timer)

  1. Foretag 5x hybridisering og 10x RNase H reaktionspuffere, og nuclease-frit vand med lineær acrylamid bærer som beskrevet i tabel 1.
  2. Nedsat hybridiseringsreaktion ved at kombinere RNA med rRNA depletion oligoer (tabel 3) og oligo (dT) på is i en 96-brønds PCR-plade som beskrevet i tabel 1.
    Bemærk: En master mix kan være forberedt. 50 femtogram (FG) i en unik syntetisk RNA (ERCCs 8) kan tilføjes til sporing både den virale sekventering processen og potentielle indeks læse krydskontaminering.
    1. Vortex forsigtigt og grundigt, centrifugeres ved 280 xg ved stuetemperatur i 1 min.
      Inkuber ved 95 ° C i 2 min, langsom ramping til 45 ° C med -0,1 ° C pr sekund. Pause thermocycler ved 45 ° C.
  3. Opsæt RNase H reaktion mix på is som beskriverd i tabel 1, derefter forvarmes ved 45 ° C i 2 min. Bemærk: En master mix kan være forberedt.
    1. Tilsæt forvarmede RNase H mix til hybridiseringsreaktionen i plade samtidig holde pladen i thermocycler ved 45 ° C.
    2. Bland godt ved forsigtig pipettering 6 - 8 gange. Inkuber ved 45 ° C i yderligere 30 minutter. Placer på is.
  4. Opsæt DNase reaktionsblandingen på is som beskrevet i tabel 1 Bemærk:. En master mix kan være forberedt.
    1. Føje til RNase H reaktionen i plade, vortex forsigtigt og grundigt, centrifugeres ved 280 xg ved stuetemperatur i 1 min. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
    2. Stop DNase reaktionen ved tilsætning af 5 pi 0,5 M EDTA. Vortex forsigtigt og grundigt, centrifugeres ved 280 xg ved stuetemperatur i 1 min.
  5. Oprydning anvendelse af RNA perler (se trin 1.3) under anvendelse af en 1,8 x volumen (144 pi) perler. Eluere i 11 pi nuclease-frit vand. Bemærk: For sikker fryselager, butik udtømt RNA prøver ved -80 ° C O / N.

3. cDNA Synthesis (~ 6 timer)

  1. Mix rRNA / carrier-depleteret RNA med tilfældige primere på is i en 96-brønds PCR-plade som beskrevet i tabel 1, vortex forsigtigt og grundigt, centrifugeres ved 280 xg ved stuetemperatur i 1 min.
    1. Blandingen opvarmes til 70 ° C i 10 minutter i en thermocycler. Umiddelbart efter varmedenaturering, placeres RNA på is i 1 - 5 min. Lad ikke RNA stå (selv på is) i mere end 5 minutter før den første streng reaktion.
  2. Opsæt første-streng syntese reaktionsblandingen på is, som beskrevet i tabel 1.
    Bemærk: En master-mix kan være forberedt.
    1. Tilføj til RNA / random primer mix i plade, vortex forsigtigt og grundigt, centrifugeres ved 280 xg ved stuetemperatur i 1 min. Inkuber ved 22 - 25 ° C i 10 minutter.
    2. Inkuber ved 55 ° C i en luft-inkubator i 60 min. Pladen anbringes på is for at afslutte reaktionen. Ikkee: Anvendelsen af ​​en luft-inkubator anbefales at skabe en gradvis opvarmning af første streng reaktion under hvilken primerne annealer og den første streng begynder at aflang.
  3. Opsæt anden streng syntese reaktionsblandingen på is, som beskrevet i tabel 1.
    Bemærk: En master-mix kan være forberedt.
    1. Føje til første-streng syntese reaktionen i pladen, vortex forsigtigt og grundigt, centrifugeres ved 280 xg ved stuetemperatur i 1 min. Inkuber i 2 timer ved 16 ° C (holde låget ved 25 ° C). Lad ikke temperaturen at stige over 16 ° C.
    2. Pladen anbringes på is, derefter inaktivere reaktionen ved tilsætning af 5 pi 0,5 M EDTA, bland forsigtigt og grundigt, centrifugeres ved 280 xg ved stuetemperatur i 1 min.
  4. Oprydning med DNA perler (se trin 1.3 til protokol) bruger 1,8x volumen (153 ul) af perler. Eluere i 9 pi elueringsbuffer (EB). Spar 1 pi til kvantificering. Brug 1 ng cDNA for subsequent trin. Hvis cDNA koncentrationen er for lav til at påvise, anvende 4 pi cDNA for tagmentation (se trin 4.1).
  5. For sikker fryselager, butik dobbeltstrenget cDNA ved 4 ° CO / N eller -20 ° C i langtidsopbevaring.

4. Bibliotek Forberedelse - DNA Bibliotek Construction (~ 4 timer)

  1. Transfer 4 pi cDNA til en 96-brønds plade og gemme den resterende cDNA for et andet forsøg, hvis nødvendigt.
  2. Opsæt tagmentation reaktion på is som beskrevet i tabel 1.
    Bemærk: En master-mix kan være forberedt. For at reducere baggrund og samlede omkostninger, er det totale volumen af ​​tagmentation reaktion reduceret fra 20 til 10 pi. Da cDNA er den begrænsende faktor, er mængden af ATM (dvs. transposome) anvendes i reaktionen også reduceret for at reducere antallet af integrationssteder.
    1. Tilføj tagmentation mix til cDNA i pladen, vortex forsigtigt og grundigt og der centrifugeres ved 280 xg (ved stuetemperatur) i 1 min.Inkuber ved 55 ° C i 5 min, fastholdelse ved 10 ° C.
    2. Når ved 10 ° C, straks tilsættes 2,5 ul Neutralize Tagment Buffer (NT) for at afslutte reaktionen. Bland ved pipettering op og ned, centrifugeres ved 280 xg (ved stuetemperatur) i 1 min.
    3. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
  3. Opsæt PCR amplifikationsreaktion på is som beskrevet i tabel 1.
    1. Vortex forsigtigt og grundigt, centrifugeres ved 280 xg ved stuetemperatur i 1 min.
    2. Udfør PCR på thermocycler under anvendelse af betingelserne beskrevet i tabel 1.
      Bemærk: 12 cykler PCR foreslås til 1 ng tagmented cDNA; imidlertid virale kliniske prøver har ofte upåviselige mængder af cDNA. For lave mængder af cDNA (<1 ng), bruge op til 18 cykler af PCR at skabe nok bibliotek til sekventering.
  4. Bibliotek forberedelse - oprydning og samle for sekventering
    1. Bring prøve op til 50 pi med EB.
    2. Oprydning medDNA-perler (se trin 1.3 til protokol) bruger 0,6x volumen (30 pi) perler. Eluere i 15 pi EB.
    3. Bestem koncentrationen af biblioteket (figur 3), som foretager region analyse (150 til 1.000 bp) ved anvendelse Bioanalyzer software 9, eksklusive primerdimerer (~ 120 bp) fra region analyse. Bemærk: Alternativt kan qPCR bruges til at kvantificere biblioteker 10.
    4. Pool biblioteker til den laveste molære koncentration af 1 nM eller større. Hvis biblioteket er under 1 nM, tilsættes en lille mængde af biblioteket til pool (~ 1x volumen af ​​andre biblioteker) til at fange sekvensinformation fra disse biblioteker.
    5. Oprydning pool med 0,7x DNA perler som skitseret ovenfor (se trin 2). Eluere i 15 pi EB. Bemærk: Volumen af ​​perler vil afhænge af det endelige volumen af ​​puljen.
    6. Analyser pool 9. Bestem molær koncentration ved at foretage region analyse (150 til 1.000 bp) 9. Bemærkning: Alternativt kan qPCR anvendes til at kvantificere bibliotekspulje 10 </ Sup>.
    7. Load sequencer ved 22:00 bibliotek koncentration til at generere 101 bp, parret ende læser med dual stregkode læser 11.

Figur 3
Figur 3. Biblioteker konstrueret fra Ebola Virus kliniske prøver. Gel billede af 4 repræsentant Ebola virus (EBOV) biblioteker. Regioner i biblioteks- og primerdimerer vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Representative Results

Den beskrevne protokol muliggør generering af høj kvalitet sekventering læser fra lav-input virale RNA-prøver, mens berigende for unikt viral indhold. Som vist i figur 1, protokollen beriget unikt Lassa virus indhold mindst fem gange i alle prøver (sammenlignet med ikke-udtømte kontroller) med mindst en million kopier af 18S rRNA (~ 100 pg totalt RNA). Ligeledes sekventering succes også korreleret med mængden af ​​virus i en given prøve. Brug af QRT-PCR som et surrogat for viral mængde, prøver, der indeholdt ~ 1.000 eller flere virale genom kopier oftest skabt fuldstændige samlinger (data ikke vist). Endvidere udtømning af poly (rA) bærer reducerer homopolymere sekvenser af A og T i biblioteker, hvilket resulterer i renere præparater og sikre en bedre kvalitet sekventering læser (figur 2). Afsluttende biblioteker fra lav input virale kliniske prøver ofte har en bred fragment længde fra 150 til 1000 bp(Figur 3).

Efter sekventering, at reducere prøven fejlidentifikation og krydstale mellem biblioteker inden for en pulje 12, kun indeks læser med en base kvalitet score på 25 (Q25) og sikre nul uoverensstemmelser holdes under demultipleksende processen. Virusgenomer er samlet under anvendelse af en bioinformatik rørledning specifikt for divergerende vira 2,4-6. Disse værktøjer er tilgængelige på https://github.com/broadinstitute/viral-ngs eller gennem kommercielle cloud-platforme 4.

Trin 1.1: DNase reaktion
Reagens Volumen pr reaktion (pi)
10x DNase buffer 7
Nuklease-frit vand 6
Ekstraheret viralt RNA 55
DNase (2 U / & #181; l) 2
totalvolumen 70
Trin 2.1: 5x hybridiseringspuffer
Reagens Volumen for 1 ml (pi)
5 M NaCl 200
1 M Tris-HCI (pH 7,4) 500
Nuklease-frit vand 300
totalvolumen 1.000
Trin 2.1: 10x RNase H reaktionsbuffer
Reagens Volumen for 1 ml (pi)
5 M NaCl 200
1 M Tris-HCI (pH 7,5) 500
1 M MgCl2 200
Nuklease-frit vand 500
totalvolumen 1.000
Trin 2.1: Vand wed lineær acrylamid
Reagens Volumen i 1 ml puffer (pi)
Nuklease-frit vand 992
Lineær acrylamid (5 mg / ml) 8
totalvolumen 1.000
Trin 2.2: hybridiseringsreaktion til selektiv depletion
Reagens Volumen pr reaktion (pi)
5x hybridiseringsbuffer 2
rRNA-depletion oligo mix (100 uM) 1.22
Oligo (d) T (550 ng / pl) 1
DNase-behandlede total RNA op til 5
Spike-i RNA (Dette er valgfrit) 0.5
Vand (med lineær acrylamid) bringe op til 10 i alt
Samlet VOLUmig 10
Trin 2.3: RNase H reaktion til selektiv depletion
Reagens Volumen pr reaktion (pi)
10x RNase H Reaction Buffer 2
Vand (med lineær acrylamid) 5
Termostabil RNase H (5 U / pl) 3
totalvolumen 10
Trin 2.4: DNase reaktion indlæg selektiv udtynding
Reagens Volumen pr reaktion (pi)
10x DNase Buffer 7.5
Vand (med lineær acrylamid) 44.5
RNase-inhibitor (20 U / pl) 1
RNase-fri DNase I (2,72 U / pl) 2 Samlet volumen (med RNase H reaktion) 75
Trin 3.1: cDNA-syntese, tilfældig primer-hybridisering
Reagens Volumen pr reaktion (pi)
rRNA / carrier-udtømte RNA 10
3 ug tilfældig primer 1
totalvolumen 11
Trin 3.2: Første streng cDNA-syntesereaktionen
Reagens Volumen (pi)
5x First-Strand Reaction Buffer 4
0,1 M DTT 2
10 mM dNTP-blanding 1
RNase-inhibitor (20 U / pl) 1
Revers transkriptase (tilføje sidste) 1
Samlet volumen (med RNA ovenfor) </ Td> 20
Trin 3.3: Anden streng cDNA-syntesereaktionen
Reagens Volumen (pi)
RNase-frit vand 43
10x Second-Strand Reaction Buffer 8
10 mM dNTP-blanding 3
E. coli-DNA-ligase (10 U / pl) 1
E. coli DNA-polymerase I (10 U / pl) 4
E. coli RNase H (2 U / pl) 1
Samlet volumen (med en st streng reaktion) 80
Trin 4.2: Tagmentation reaktion
Reagens Volumen (pi)
Amplikon Tagment Mix (ATM) 1
Tagment DNA Buffer (TD) 5
Samlet volumen (med cDNA) 10
Trin 4.3: Library PCR-reaktion
Reagens Volumen (pi)
PCR Master Mix (NPM) 7.5
Indeks 1 primer (i7) 2.5
Indeks 2 primer (i5) 2.5
Samlet volumen (med tagmented cDNA) 25
Trin 4.3.2: Bibliotek PCR betingelser
72 ° C, 3 min
95 ° C, 30 sekunder
op til 18 cyklusser-10 sek ved 95 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C, 30 sekunder ved 72 ° C
72 ° C, 5 min
10 ° C, for evigt

Tabel 1:. Reaktion opsætning og buffere Trin-for-trin tabeller med indholdet af alle buffere og reaktionsblandinger.

Tabel 2: QRT-PCR-primere Sekvenser primere anvendt til måling vært (18S rRNA) og viral indhold (Ebola og Lassa).. "KGH 'er Kenema regering Hospital i Sierra Leone, hvor Ebola primere blev testet to. 'Kulesh' er investigator som designede primeren sæt 14.

Tabel 3: ribosom RNA (rRNA) Udtømning Oligo 195 50-nukleotid lange sekvenser komplementære for menneskers rRNA til selektiv udtynding trin 6.. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den skitserede tilgang gør det muligt robust, universel, hurtig sekventering og blev brugt til sekventering Ebola virus under 2014 udbruddet 2,4. Ved at koble selektiv udtynding og cDNA syntese med tagmentation bibliotek byggeri, blev den samlede procestid reduceret med ~ 2 dage fra tidligere adapter ligeringsfremgangsmåder. For nylig blev denne protokol ansat af internationale samarbejdspartnere og andre med stor succes 15,16 og vil blive udsendt til laboratorier i Vestafrika for at støtte lokale genomics-baserede undersøgelser og diagnostik 17.

Protokollen beskrevet her bruger vilkårlige primere til at forberede cDNA for virale RNA-seq biblioteker. I modsætning til tidligere virale RNA-seq tilgange, det kræver ingen a priori kendskab til sekvensdata eller omstændelig og tidskrævende primer design for et specifikt virus eller clade. Fremgangsmåden kan anvendes på enhver viral RNA-prøve. For eksempel blev det brugt til at generere viral indhold fra både Ebolaog Lassa prøver 6. Protokollen kan også bruges til vært transkriptom, metagenomisk og patogen discovery sekventering projekter 1.

Et kritisk trin i protokollen er målrettet RNase H spaltning, en high-throughput, billig metode til fjernelse af uønsket bærer og vært RNA fra virale prøver. Den selektive udtømning trin i protokollen bruger mange komponenter og kræver dygtighed og nøjagtighed. bør der udvises ekstra tid og pleje under den første opsætning.

Som de fleste kliniske serum- og plasmaprøver ofte har meget lidt nukleinsyremateriale, forurening og prøvetab er almindelige. For at undgå disse problemer, bør man være særlig opmærksom ved brug af denne protokol. Første, RNA er meget modtagelige for nedbrydning; derfor alle områder skal være rene og fri for nucleaser. For det andet at identificere prøver, der er egnede til anvendelse i denne protokol, skal QRT-PCR assays for både vært RNA og virus anvendes til kvantificering 5,6 (dvs. generation af tilstrækkelige data til fuld viral samling) korreleret med prøver, der indeholdt mindst 100 pg total RNA og 1.000 kopier af virus. bør undgås tredje, udsættelse for miljømæssige årsager til nukleinsyrer. Protokollen skitseret her er gjort i et biosikkerhed skab for sikkerhedsforanstaltninger og for at begrænse miljøbelastende stoffer. Desuden har vores gruppe og andre, bemærket, at kommercielle enzymer kan være en anden kilde til kontaminerende bakterielle nukleinsyrer i lav input prøver 6,18. Anvendelse af en ren arbejdsområde (fx PCR hætte, biosikkerhed kabinet) og negative kontroller (f.eks, vand eller buffer) vil bidrage til at afhjælpe og spore kontaminering hhv. For prøver med <100 pg af total RNA, kun poly (rA) bærer-RNA, ikke rRNA, bør være udtømt for at sikre høj kvalitet sekventeringsresultaterne samtidig begrænse tab af materiale. for megetprøver lave input, kan cDNA-amplifikationsfremgangsmåder være mere passende 19, selv om poly (rA) bærer bør fjernes før cDNA-syntese.

Nedbrydningen af vært rRNA beriger for viral indhold i sekventering biblioteker og er anvendelig til forskellige prøvesamlinger herunder serum eller plasma, og flere typer af væv fra gnavere og ikke-menneskelige primater 5,6. I ikke-humane organismer, læser tilpasning til 28S rRNA tilbage efter udtømning, hvilket tyder 28S rRNA er mindre konserveret mellem mennesker og andre arter 6,20. Når denne metode anvendes med ikke-humane isolater, kan det være nødvendigt at supplere med DNA oligoer komplementære til de divergerende rRNA-sekvenser af den specifikke vært 3,21.

Da protokollen er upartisk, viral læser kan repræsentere kun en lille brøkdel af det samlede indhold bibliotek. Selvom rRNA er de mest udbredte arter af host-RNA, og kun en lille procentdel af rRNA læser (0, 1%), er fundet efter selektiv udtynding, vil alle andre vært RNA (fx mRNA) tilbage efter udtømning og kan tegne sig for mange sekventering læser fra prøven. Derfor "oversampling" (dvs. oversequencing) enkelte biblioteker er nødvendig for at få tilstrækkelig dækning for virale montage og variant opkald. For vores studier, forsøger vi at sekvensen ~ 20 mio læser per prøve at have nok dybde til analyse af viral genomisk og tilhørende varianter samt metagenomisk indhold 2,5. For metagenomisk og patogene forskningsstudier, er det vigtigt at bemærke, at kontaminerende værts-DNA fjernes ved DNase-fordøjelse. Derfor vira og andre patogener, som indeholder DNA-genomer kan gå tabt under processen, men RNA mellemprodukter kan stadig sekventeret.

Materials

Oligo Navn Sekvens (5 'til 3')
Ebola KGH FW GTCGTTCCAACAATCGAGCG
Ebola KGH RV CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT
Ebola KULESH FW TCTGACATGGATTACCACAAGATC
Ebola KULESH RV GGATGACTCTTTGCCGAACAATC
Lassa SL FW GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC
Lassa SL RV AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A
18S rRNA FW TCCTTTAACGAGGATCCATTGG
18S rRNA RV CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT
Name Company Catalog Number Comments
96-well PCR Plates VWR 47743-953
Strips of Eight Caps VWR 47745-512
Nuclease-free water Ambion AM9937 50 ml bottle
TURBO DNase Ambion AM2238 post RNA extraction step, 2 U/µl, buffer included
PCR cycler any PCR cyclers 
Agencourt RNAClean XP SPRI beads  Beckman Coulter Genomics A63987 beads for RNA cleanup
Real Time qPCR system any system
DynaMag-96 Side Skirted Magnet Invitrogen 12027
70% Ethanol prepare fresh
qRT-PCR primers IDT DNA see Table 2
5 M NaCl  Ambion AM9760G
1 M Tris-HCl pH 7.4  Sigma T2663-1L
1 M Tris-HCl pH 7.5  Invitrogen 15567-027
1 M MgCl2  Ambion AM9530G
Linear acrylamide  Ambion  AM9520
DNA oligos covering entire rRNA region IDT DNA see Table 3, order lab-ready at 100 µM
Oligo (dT) IDT DNA 40 nt long, desalted
Hybridase Thermostable RNase H  Epicentre H39100
RNase-free DNase Kit  Qiagen 79254 post selective depletion step
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Random Primers  Invitrogen 48190-011 mostly hexamers
10 mM dNTP mix New England Biolabs N0447L
SuperScript III Reverse Transcriptase  Invitrogen 18080-093 with first-strand buffer, DTT
Air Incubator any air incubator cyclers 
NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer New England Biolabs B6117S 10x
E. coli DNA Ligase New England Biolabs M0205L 10 U/μl
E. coli DNA Polymerase I  New England Biolabs M0209L 10 U/μl
E. coli RNase H New England Biolabs M0297L 2 U/μl
0.5 M EDTA Ambion AM9261
Agencourt AMPure XP SPRI beads Beckman Coulter Genomics A63881 beads for DNA cleanup
Elution Buffer  Qiagen 10 mM Tris HCl, pH 8.5
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit  Invitrogen Q32854
Qubit fluorometer  Invitrogen Q32857
Nextera XT DNA Sample Prep Kit  Illumina FC-131-1096
Nextera XT DNA Index Kit  Illumina FC-131-1001
Tapestation 2200 Agilent G2965AA
High Sensitivity D1000 reagents Agilent 5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584
BioAnalyzer 2100  Agilent G2939AA
High Sensitivity DNA reagents Agilent 5067-4626
Library Quantification Complete kit (Universal) Kapa Biosystems KK4824 alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stremlau, M. H., et al. Discovery of novel rhabdoviruses in the blood of healthy individuals from West Africa. PLoS Negl Trop Dis. 9, e0003631 (2015).
  2. Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345, 1369-1372 (2014).
  3. Morlan, J. D., Qu, K., Sinicropi, D. V. Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue. PLoS One. 7, e42882 (2012).
  4. Park, D. J., et al. Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone. Cell. 161, 1516-1526 (2015).
  5. Andersen, K. G., et al. Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus. Cell. 162, 738-750 (2015).
  6. Matranga, C. B., et al. Enhanced methods for unbiased deep sequencing of Lassa and Ebola RNA viruses from clinical and biological samples. Genome Biol. 15, 519 (2014).
  7. Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
  8. Jiang, L., et al. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21, 1543-1551 (2011).
  9. Agilennt Technologies. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf. (2015).
  10. Kapa Biosystems. , Available from: https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/ (2015).
  11. Illumina Technologies. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf. (2015).
  12. Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Res. 40, 3 (2012).
  13. Andrews, S. Babraham Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  14. Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am J Trop Med Hyg. 82, 954-960 (2010).
  15. Hu, Y., et al. Serial high-resolution analysis of blood virome and host cytokines expression profile of a patient with fatal H7N9 infection by massively parallel RNA sequencing. Clin Microbiol Infect. 21, e1-4 713 (2015).
  16. Simon-Loriere, E., et al. Distinct lineages of Ebola virus in Guinea during the 2014 West African epidemic. Nature. 524, 102-104 (2015).
  17. Folarin, O. A., Happi, A. N., Happi, C. T. Empowering African genomics for infectious disease control. Genome Biol. 15, 515 (2014).
  18. Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39, 19 (2011).
  19. Malboeuf, C. M., et al. Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification. Nucleic Acids Res. 41, 13 (2013).
  20. Gonzalez, I. L., Sylvester, J. E., Smith, T. F., Stambolian, D., Schmickel, R. D. Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny. Mol Biol Evol. 7, 203-219 (1990).
  21. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nat Methods. 10, 623-629 (2013).

Tags

Medicin RNA-virus Ebola-virus Lassa virus intra-vært varianter Lassa feber poly (rA) luftfartsselskab rRNA RNase H RT-PCR
Uvildige Deep Sekventering af RNA vira fra kliniske prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matranga, C. B., Gladden-Young, A.,… More

Matranga, C. B., Gladden-Young, A., Qu, J., Winnicki, S., Nosamiefan, D., Levin, J. Z., Sabeti, P. C. Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples. J. Vis. Exp. (113), e54117, doi:10.3791/54117 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter