पूरे प्रोटीन संतृप्ति mutagenesis पुस्तकालय के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल का उपयोग उच्च throughput अनुक्रमण
Summary
हम उच्च throughput अनुक्रमण के उपयोग प्रोटीन का व्यापक एकल साइट संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालयों के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। महत्वपूर्ण बात है, इस दृष्टिकोण orthogonal प्राइमर जोड़े का उपयोग करता पुस्तकालय निर्माण और अनुक्रमण मल्टीप्लेक्स। मंदिर-1 β-lactamase एम्पीसिलीन की एक चिकित्सकीय प्रासंगिक खुराक पर चयनित का उपयोग कर प्रतिनिधि परिणाम प्रदान की जाती हैं।
Abstract
Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to β-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.
Introduction
Mutagenesis लंबे जैविक प्रणालियों और उनके विकास के गुणों का अध्ययन करने के लिए, और बढ़ाया या उपन्यास कार्यों के साथ उत्परिवर्ती प्रोटीन या जीवों का उत्पादन करने के लिए प्रयोगशाला में नियोजित किया गया है। जबकि प्रारंभिक दृष्टिकोण तरीकों जो जीवों में यादृच्छिक म्यूटेशन उत्पादन पर भरोसा किया, पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी के आगमन के लिए सक्षम शोधकर्ताओं ने एक साइट विशेष ढंग से डीएनए के लिए चुनिंदा परिवर्तन, अर्थात्।, साइट निर्देशित mutagenesis 1,2 परिचय। मौजूदा तकनीक, आम तौर पर एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) में mutagenic ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स का उपयोग कर के साथ, यह अपेक्षाकृत किसी जीन 3,4 में बना सकते हैं और म्यूटेशन की कम संख्या (जैसे।, बिंदु उत्परिवर्तन) का आकलन करने के लिए सरल है। यह कहीं अधिक कठिन है, लेकिन जब लक्ष्य दृष्टिकोण, उदाहरण के लिए, निर्माण और मूल्यांकन के लिए सभी संभव एकल साइट के (या उच्च आदेश) म्यूटेशन।
जबकि ज्यादा मीटर की बड़ी संख्या का आकलन करने के प्रयास में प्रारंभिक अध्ययन से पता चला हैजीन में utations, तकनीक का इस्तेमाल अक्सर श्रमसाध्य थे, उदाहरण के लिए स्वतंत्र रूप से बकवास शमन का उपयोग कर प्रत्येक उत्परिवर्तन के आकलन की आवश्यकता के लिए 5-7 तनाव, या सेंगर अनुक्रमण 8 की कम अनुक्रमण गहराई के कारण उनकी मात्रात्मक क्षमता में सीमित थे। इन अध्ययनों में इस्तेमाल की तकनीक काफी हद तक उच्च throughput अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के उपयोग के तरीकों 9-12 द्वारा supplanted किया गया है। ये धारणात्मक सरल दृष्टिकोण म्यूटेशन की एक बड़ी संख्या को मिलाकर एक पुस्तकालय का निर्माण करना पड़ेगा, समारोह के लिए एक स्क्रीन या चयन करने के लिए पुस्तकालय subjecting, और फिर गहरे अनुक्रमण (अर्थात्।,> 10 6 अनुक्रमण के आदेश पर पढ़ता है) पुस्तकालय से पहले प्राप्त की और चयन के बाद। इस तरह, म्यूटेशन की एक बड़ी संख्या के प्ररूपी या फिटनेस प्रभाव, प्रत्येक उत्परिवर्ती की आबादी आवृत्ति में परिवर्तन के रूप में प्रतिनिधित्व, एक साथ और अधिक मात्रात्मक आकलन किया जा सकता है।
हम पहले एक भोला आदमी की शुरुआत की(। यानी, पूरे प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालयों) प्रोटीन में सभी संभव एकल एमिनो एसिड म्यूटेशन के पुस्तकालयों का आकलन करने, अनुक्रमण से अधिक समय लंबाई के साथ जीन को लागू करने के लिए Le दृष्टिकोण लंबाई 11,13 पढ़ें: पहला, प्रत्येक अमीनो एसिड स्थिति बेतरतीब है द्वारा साइट निर्देशित mutagenic पीसीआर। इस प्रक्रिया के दौरान, जीन कुल लंबाई अनुक्रमण मंच द्वारा समायोजित के साथ सटे पदों से बना समूहों में विभाजित है। प्रत्येक समूह के लिए mutagenic पीसीआर उत्पादों तब संयुक्त रहे हैं, और प्रत्येक समूह के लिए स्वतंत्र रूप से चयन और उच्च throughput अनुक्रमण के अधीन है। अनुक्रम और अनुक्रमण पढ़ें लंबाई में म्यूटेशन के स्थान के बीच एक पत्राचार बनाए रखने से, इस दृष्टिकोण को अधिकतम अनुक्रमण गहराई का लाभ दिया है। जबकि एक बस जैसे समूहों (एक मानक बन्दूक द्वारा में बंटवारे के बिना कम खिड़कियों में इस तरह के पुस्तकालयों अनुक्रम कर सकता है अनुक्रमण दृष्टिकोण), सबसे अधिक प्रकार के जंगली और इस प्रकार मीटर होगा प्राप्त पढ़ताअनुक्रमण throughput व्यर्थ की ajority (जैसे, एक 500 अमीनो एसिड प्रोटीन 100 अमीनो एसिड (300 बीपी) Windows में अनुक्रम की एक पूरी प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालय के लिए, कम से कम 80% से कम पढ़ता जंगली प्रकार के अनुक्रम) हो जाएगा।
इधर, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जो पूरे प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालयों के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए उच्च throughput अनुक्रमण का इस्तेमाल करता है, ऊपर दृष्टिकोण (चित्रा 1 में उल्लिखित) का उपयोग। महत्वपूर्ण बात है, हम प्रत्येक दृश्य समूह है, जो उन्हें एक पुस्तकालय में मल्टिप्लेक्स जा करने के लिए अनुमति देता है, स्क्रीनिंग या चयन करने के लिए एक साथ अधीन बारकोड के पुस्तकालय क्लोनिंग की प्रक्रिया में ओर्थोगोनल प्राइमरों के उपयोग लागू करने, और गहरी अनुक्रमण के लिए तो डी-मल्टिप्लेक्स। चूंकि अनुक्रम समूहों स्वतंत्र रूप से चयन के अधीन नहीं हैं, इस काम का बोझ कम कर देता है और यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक उत्परिवर्तन चयन का एक ही स्तर का अनुभव। मंदिर-1 β-lactamase, एक एंजाइम है जो करने के लिए उच्च स्तरीय प्रतिरोध प्रदानβ-lactam एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे।, एम्पीसिलीन) बैक्टीरिया में एक मॉडल प्रणाली 14-16 के रूप में इस्तेमाल किया जाता है। एक प्रोटोकॉल ई में मंदिर-1 की एक पूरी प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालय के आकलन के लिए वर्णन किया गया है एम्पीसिलीन की एक चिकित्सीय खुराक (50 माइक्रोग्राम / एमएल) 17,18 के लिए एक अनुमानित सीरम स्तर पर चयन के तहत कोलाई।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ एक प्रोटोकॉल, पूरे प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालयों के कार्यात्मक मूल्यांकन प्रदर्शन उच्च throughput अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर के लिए वर्णित है। विधि का एक महत्वपूर्ण पहलू क्लोनि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.R. acknowledges support from the National Institutes of Health (RO1EY018720-05), the Robert A. Welch Foundation (I-1366), and the Green Center for Systems Biology.
Materials
| Typtone | Research Products Intl. Corp. | T60060-1000.0 | |
| Yeast extract | Research Products Intl. Corp. | Y20020-500.0 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | |
| petri plates | Corning | 351029 | |
| MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ | |
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos | 25 nmol scale, standard desalting |
| pBR322_AvrII | available upon request | pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene | |
| pBR322_OP1 – pBR322_OP5 | available upon request | five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491L | includes 5X PCR buffer and PCR additive (GC enhancer) |
| 15 mL conical tube | Corning | 430025 | |
| Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) | Eppendorf | ||
| PCR plate, 96 well | Fisher Scientific | 14230232 | |
| 96 well plate seal | Excel Scientific | F-96-100 | |
| Veriti 96-well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| 6X gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| Agarose | Research Products Intl. Corp. | 20090-500.0 | |
| Ethidium bromide | Bio-Rad | 161-0433 | |
| UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) | Fotodyne Inc. | http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| 96-well black-walled, clear bottom assay plates | Corning | 3651 | |
| Lambda phage DNA | New England Biolabs | N3011S | |
| PicoGreen dsDNA reagent | Invitrogen | P7581 | dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4 |
| Victor 3V microplate reader | PerkinElmer | ||
| DNA purification kit | Zymo Research | D4003 | |
| Microcentrifuge tubes | Corning | 3621 | |
| Long-wavelength UV illuminator | Fisher Scientific | FBUVLS-80 | |
| Agarose gel DNA extraction buffer | Zymo Research | D4001-1-100 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174L | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| EVB100 electrocompetent E. coli | Avidity | EVB100 | |
| Electroporator (E. coli Pulser) | Bio-Rad | 1652102 | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro) | Amersham Biosciences | 80211237 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430828 | |
| Plasmid purification kit | Macherey-Nagel | 740588.25 | |
| 8 well PCR strip tubes | Axygen | 321-10-551 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32854 | dsDNA quantitation reagent |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Ampicillin sodium salt | Akron Biotechnology | 50824296 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500 cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| MiSeq desktop sequencer | Illumina | http://www.illumina.com/systems/miseq.html | alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform |
| FLASh software | John Hopkins University – open source | http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ | software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data |
| AatII_F | GATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGC | ||
| AvrII_R | CTTCACCTAGGTCCTTTTAAATTAAAAATGAAG | ||
| AvrII_F | CTTCATTTTTAATTTAAAAGGACCTAGGTGAAG | ||
| AatII_OP1_R | ACCTGACGTCCGTATTTCAACTGTCCGGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAAC | ||
| AatII_OP2_R | ACCTGACGTCCGCTCACGGAGTGTACTAATTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAAC | ||
| AatII_OP3_R | ACCTGACGTCGTACGTCTGAACTTGGGACTTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAAC | ||
| AatII_OP4_R | ACCTGACGTCCCGTTCTCGATACCAAGTGATAAGAAACCATTATTATCATGACATTAAC | ||
| AatII_OP5_R | ACCTGACGTCGTCCGTCGGAGTAACAATCTTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAAC | ||
| OP1_F | GACCGGACAGTTGAAATACG | ||
| OP1_R | CGACGTACAGGACAATTTCC | ||
| OP2_F | ATTAGTACACTCCGTGAGCG | ||
| OP2_R | AGTATTAGGCGTCAAGGTCC | ||
| OP3_F | AGTCCCAAGTTCAGACGTAC | ||
| OP3_R | GAAAAGTCCCAATGAGTGCC | ||
| OP4_F | TCACTTGGTATCGAGAACGG | ||
| OP4_R | TATCACGGAAGGACTCAACG | ||
| OP5_F | AGATTGTTACTCCGACGGAC | ||
| OP5_R | TATAACAGGCTGCTGAGACC | ||
| Group1_F | ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGCATTTTGCCTACCGGTTTTTGC | ||
| Group1_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNTCTTGCCCGGCGTCAAC | ||
| Group2_F | ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGAACGTTTTCCAATGATGAGCAC | ||
| Group2_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAG | ||
| Group3_F | ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC | ||
| Group3_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNTCGCCAGTTAATAGTTTGCGC | ||
| Group4_F | ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNCCAAACGACGAGCGTGACAC | ||
| Group4_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNGCAATGATACCGCGAGACCC | ||
| Group5_F | ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNCGGCTGGCTGGTTTATTGC | ||
| Group5_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNTATATGAGTAAACTTGGTCTGACAG | ||
| 501_F | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGAC | ||
| 502_F | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATAGAGGCACACTCTTTCCCTACACGAC | ||
| 503_F | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTATCCTACACTCTTTCCCTACACGAC | ||
| 504_F | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTCTGAACACTCTTTCCCTACACGAC | ||
| 505_F | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGCGAAGACACTCTTTCCCTACACGAC | ||
| 701_R | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTG | ||
| 702_R | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCCGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTG |
References
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