Summary
Qui vi presentiamo un protocollo per indagare genoma metilazione del DNA in studi clinici di screening dei pazienti su larga scala utilizzando il metil-Binding sequenziamento del DNA di cattura (MBDCap-ss o MBD-ss), la tecnologia e la successiva analisi bioinformatica pipeline.
Abstract
La metilazione è una delle modificazioni epigenetiche essenziali al DNA, che è responsabile per la precisa regolazione dei geni necessari per lo sviluppo stabile e differenziazione dei diversi tipi di tessuto. Disregolazione di questo processo è spesso il segno distintivo di varie malattie come il cancro. Qui, si delineano uno dei recenti tecniche di sequenziamento, Metil-Binding DNA Capture sequenziamento (MBDCap-ss), utilizzato per quantificare la metilazione in vari tessuti normali e di malattia per i grandi coorti di pazienti. Descriviamo un protocollo dettagliato di questo approccio arricchimento affinità con un oleodotto bioinformatica per raggiungere quantificazione ottimale. Questa tecnica è stata utilizzata per sequenziare centinaia di pazienti in vari tipi di cancro come parte del progetto 1.000 methylome (Cancer Methylome System).
Introduction
Regolazione epigenetica di geni attraverso metilazione del DNA è uno dei meccanismi essenziali necessari per determinare il destino della cellula dalla differenziazione stabile di diversi tipi di tessuto nel corpo 1. Disregolazione di questo processo è stato conosciuto per causare varie malattie tra cui il cancro 2.
Questo processo comporta principalmente l'aggiunta di gruppi metilici sul residuo citosina in dinucleotidi CpG del DNA 3. Esistono alcune tecniche diverse attualmente utilizzate per indagare questo meccanismo, ciascuno con i propri vantaggi come indicato in molti studi 2-8. Qui discuteremo una di queste tecniche chiamati Metil-Binding DNA Capture sequenziamento (MBDCap-ss), dove utilizziamo una tecnica di affinità arricchimento per identificare le regioni metilato del DNA. Questa tecnica si basa sulla capacità metil-legame della proteina MBD2 per arricchire i frammenti di DNA genomico contenenti denaturato siti CpG. Utilizziamo un kit di arricchimento DNA metilato commercialeper l'isolamento di tali regioni metilati. Il nostro laboratorio ha proiettato in centinaia di campioni di pazienti con questa tecnica e qui mettiamo a disposizione un protocollo ottimizzato completo, che può essere utilizzato per studiare grandi coorti di pazienti.
Come evidente con qualsiasi tecnologia di sequenziamento di prossima generazione, MBDCap-ss richiede anche un approccio bioinformatico specifiche al fine di quantificare con precisione i livelli di metilazione attraverso i campioni. Ci sono stati molti studi recenti, nel tentativo di ottimizzare il processo di normalizzazione e l'analisi dei dati di sequenziamento 9, 10. In questo protocollo, dimostriamo uno di questi metodi di attuazione di un approccio unico di recupero lettura - LONUT - seguita dalla normalizzazione lineare di ogni campione, al fine di consentire il confronto imparziali attraverso gran numero di campioni di pazienti.
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Protocol
Tutti i tessuti sono ottenuti a seguito approvazione del comitato Institutional Review Board e quando tutti i partecipanti acconsentito ad entrambe le analisi molecolari e studi di follow-up. I protocolli sono approvati dal Comitato studi sugli esseri umani presso l'Università del Texas Health Science Center a San Antonio.
1. Metil-legame al DNA di cattura (MBDCap)
- Raccolta dei campioni e l'isolamento del DNA
- Raccogliere tumore alla rinfusa o normali campioni di tessuto da campioni di tessuto inclusi in paraffina paziente.
- Utilizzare un mini DNA kit commerciale per isolare DNA genomico da campioni di tessuto inclusi in paraffina secondo il protocollo del produttore.
- Utilizzare un kit di arricchimento DNA metilato con la procedura qui descritta secondo il protocollo del produttore.
- Lavaggio tallone iniziale
Nota: Le perle sono impiegati per accoppiare con MBD-biotina proteine, che rileva la metilazione del DNA sul genoma. Perle di solito sono sospesiin una soluzione madre. Utilizzare questa procedura per lavare questo liquido.- Risospendere il magazzino di perline streptavidina (vedi Materiali Tavolo) pipettando gentilmente su e giù per ottenere una sospensione omogenea. Non mescolare le perline nel vortex.
- Per uno mg di DNA di ingresso, Add10 ml di perline per un tubo con 90 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio. Ruotare per 1 min. Non mescolare nel vortex.
- Posizionare il tubo (s) su un sostegno magnetico per 1 min.
- Rimuovere il liquido con una pipetta e scartare il liquido.
- Aggiungere 250 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio ai talloni e ruotare per 1 min.
- Ripetere i punti 1.2.3 - 1.2.5 due volte.
- Accoppiamento la proteina MBD-biotina alle perline
- Per 1.2 mg di DNA di input, aggiungere 7 ml (3,5 mg) di proteine MBD-biotina ad ogni provetta.
- Aggiungere 93 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio alla proteina di fare un volume finale di 100 ml.
- Mescolare il perline-proteinacomposto su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 1 h.
- Frammentato DNA (ingresso)
- DNA Sonicare con l'aggiunta di 1,2 mg di DNA genomico totale in 96 ml di tampone TE e 24 ml di tampone di 5x / lavaggio Bind per ottenere una soluzione di 120 ml. Utilizzare 30 s ON potenza e 30 s OFF alimentazione durante sonicazione, 20 - 25 volte.
- Eseguire 1 ml di soluzione di DNA sonicato utilizzando un sistema bioanalyzer con un kit commerciale DNA alta sensibilità per controllare la dimensione dei frammenti per essere nell'intervallo di: 150 - 350 bp secondo il protocollo del produttore.
- Lavare le MBD-perline
- Posizionare il tubo contenente MBD-perline su un sostegno magnetico per 1 minuto.
- Rimuovere e gettare il liquido con una pipetta senza toccare le perline.
- Risospendere le sfere con 250 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio.
- Mescolare le perline su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 5 min.
- Ripetere i punti 1.5.1 - 1.5.4 due volte.
- Reazione di cattura del DNA frammentato (1 mg DNA di ingresso)
- Trasferire la miscela di DNA / Buffer alla provetta contenente le MBD-perline.
- Mescolare le MBD-perline con il DNA su un agitatore rotante per 1 ora a RT. In alternativa, mescolare O / N a 4 ° C.
- Rimozione di DNA non catturato dalle perline
- Dopo la miscelazione il DNA e MBD-perline, posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 1 min di concentrare tutte le perline sulla parete interna del tubo.
- Rimuovere il surnatante con una pipetta e salvarlo in un free-DNasi provetta pulita microcentrifuga come DNA nonmethylated. Conservare questo campione sul ghiaccio.
- Aggiungere 200 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio per le perline per lavare le perline.
- Mescolare le perline su un agitatore rotante per 3 min.
- Posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 1 min.
- Rimuovere il liquido con una pipetta e salvarlo in una provetta.
- per capture reazioni di ≤1 mg di DNA di ingresso, ripetere i punti 1.7.3 - 1.7.6 per altre 2 frazioni di lavaggio in totale.
- Eluizione frazione singolo
- Mescolare buffer di basso contenuto di sale con tampone alto contenuto di sale (1: 1) per ottenere tampone di eluizione (1.000 mm NaCl).
- Risospendere le sfere in 200 microlitri di tampone di eluizione (1.000 mm NaCl).
- Incubare le perline su un miscelatore rotante per 3 min.
- Posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 1 min.
- Con il tubo in posizione sulla griglia magnetica, rimuovere il liquido con una pipetta senza toccare le perle con la punta della pipetta, e salvarla in un 1,5 ml provetta senza DNasi pulito. Conservare questo campione sul ghiaccio.
- Ripetere i punti 1.8.1 - 1.8.4 volta, raccogliendo il secondo campione nella stessa provetta (volume totale sarà di 400 microlitri). Conservare il campione in pool sul ghiaccio.
- Etanolo precipitazioni (cleanup DNA)
- Per ogni noncaptured, lavaggio, e eluizione frazione from i passaggi precedenti, aggiungere 1 ml di glicogeno (20 mg / mL, incluso nel kit), il volume 1/10 campione di sodio acetato 3M, pH 5.2 (ad esempio, 40 ml per 400 ml di campione) e 2 volumi di campione di 100% etanolo (ad esempio, 800 microlitri per 400 microlitri di campione). Il volume totale è di 1.241 ml.
- Mescolare bene e incubare a -80 ° C per almeno 2 ore.
- Centrifugare la provetta per 15 min a 11.363 xg a 4 ° C.
- Eliminare attentamente il surnatante senza disturbare il pellet.
- Aggiungere 500 ml di freddo il 70% di etanolo.
- Centrifugare la provetta per 5 minuti a 11.363 xg a 4 ° C.
- Eliminare attentamente il surnatante senza disturbare il pellet.
- Ripetere i punti 1.9.6 - 1.9.7 volta e rimuovere ogni residuo di surnatante rimanente.
- Far asciugare il pellet per ~ 5 min. Non asciugare completamente il pellet.
- Risospendere il pellet di DNA in 37,5 ml di acqua priva di DNasi o altroadeguato volume di tampone.
- Posizionare il DNA su ghiaccio o conservare il DNA a -20 ° C o al di sotto fino a nuovo uso.
- Verificare che la quantità totale di DNA è superiore a 20 ng, (ad esempio, usare il sistema di quantificazione fluorimetrica, vedi Materiali Tavolo).
2. Sequencing
- Utilizzare i frammenti di DNA recuperati dalla procedura MBDCap per il sequenziamento. Per ogni campione da sequenziato, un importo totale di 20 - 40 ng DNA è necessario per la preparazione biblioteca.
- Per la preparazione biblioteca DNA-Seq usare un sistema di costruzione di biblioteche completamente automatizzato (vedi Materiali Tavolo) e seguire il protocollo standard fornito dal produttore. Selezionare i frammenti di DNA di dimensioni 200-400 bp per la preparazione biblioteca. Il sistema di preparazione biblioteca di automazione permette di standardizzare la procedura di preparazione biblioteca e riducendo al minimo la variazione tra i campioni a causa di preparazione manuale.
- Utilizzare l'adattatore Primers e portare a concentrazione 100x. Di questo, utilizzare 10 microlitri per ogni campione.
- Seguendo passo 2.2, prendere la reazione, e quantificare la libreria di DNA-ss utilizzando un sistema di quantificazione fluorimetrico (vedi Materiali Tavolo).
- Impostare procedura di amplificazione PCR. La scelta di PCR master mix è di migliorare l'efficienza della PCR di GC arricchito regione del genoma. In un tubo di PCR, aggiungere biblioteca 15 microlitri di DNA-ss, 25 microlitri PCR Master Mix (vedi Materiali Tavolo), 2 microlitri PCR Primer Mix (vedi Materiali Tavolo), e 8 ml H 2 O.
- Seguire raccomandazione PCR dal produttore del master mix PCR, alterando i tempi di ciclismo e le temperature per diversi materiali di partenza: 98 ° C per 45 s, X cicli di 98 ° C per 15 s, 65 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s, quindi 72 ° C per 1 min. Tenere a 4 ° C.
- Perform abbastanza cicli di finire con 2-10 nM di DNA biblioteca (8 - 10 cicli).
- Pulire reazione PCR con rapporto 1: 1 di PCR perline purificazione secondo il protocollo del produttore (vedi Materiali Tavolo).
- Eluire con 20 - 30 microlitri di tampone di eluizione.
- Codice a barre ogni campione e piscina 4 campioni insieme in una corsia di una cella di flusso. Utilizzare il 50 bp unico protocollo lettura standard per il sequenziamento (vedi Materiali Tavolo).
3. Analisi Bioinformatica
Nota: ulteriore processo i file FASTQ grezzi ottenuti dal sequenziamento per eseguire il controllo qualità e la mappatura delle brevi sequenze di DNA (legge) al genoma.
- Usa Bowtie breve lettura di allineamento, strumento di mappatura del genoma su ciascun file di esempio FASTQ per mappare la legge per il genoma di riferimento. Molti strumenti di mappatura di lettura sono a disposizione per eseguire questo passaggio e può essere utilizzato in base alle preferenze individuali.
- Attendere fino a 2 disallineamenti nel da te legge mentre la mappatura del genoma di riferimento. Segnala fino a 20 migliori allineamenti per ogni lettura. Ad esempio, utilizzare papillon -v 2 --migliore -k 20 --chunkmbs 200 <ebwt> <fastqFile> <alignFile>.
- Utilizzare LONUT 9 di recuperare il moltiplicano mappato legge per migliorare l'individuazione delle regioni arricchite. Per ogni lettura, al più un allineamento potrebbe essere recuperato quando è abbastanza vicino a qualsiasi delle sopra dette picchi. Ad esempio, utilizzare: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 <alignFile> <OutputPath>. LONUT eseguirà le seguenti operazioni.
- allineamenti diviso in mappati in modo univoco legge e si moltiplicano mappati legge. Picco di chiamate sulla mappata univocamente legge utilizzando picco chiamante nastro 11. L'opzione -w 250 e -p 99 nel comando esempio sono per la cintura.
- Combina in modo univoco mappato legge con il recuperato letture ottenuto da LONUT, e il combinato legge, in formato LETTO, verranno utilizzati in ulteriori analisi. Calcolare il numero di CombinEd legge per il futuro la normalizzazione.
- Bin la legge. Estratto di legge nella regione di interesse utilizzando script perl: perl methyPipeline.pl <sampleInfoFile> <refGeneFile> up <estende a monte lunghezza> -dn <valle lunghezza si estende>. Per ogni file letto elencato nel sampleInfoFile, lo script perl esegue i compiti di seguito.
Nota: Vedere file di codifica supplementare per lo script Perl.- Bin la legge in formato bin fisso, ad esempio, 100 bp, per 24 cromosomi.
- Per ogni gene specificato nel refGeneFile, estrarre i cassonetti intorno sito di inizio della trascrizione (TSS), fino alla lunghezza estensione specificata da un'opzione up e -dn. Ad esempio, estrarre i dati nella regione che è a monte ea valle 4 kb di TSS. A bin dimensioni 100 bp, questo estratto i dati hanno 81 bidoni, e il bidone centrale corrisponde al TSS.
- Per il gene sul filamento antisenso, capovolgere la regione estratta da sinistra a destra in modo che bidoni monte sono sempre placed sulla sinistra con lo script Perl.
- Ulteriori dividere il TSS ± regione 4 kb in tre regioni sub: a sinistra, a monte 4 kb a monte 2 kb; Medio, a monte ea valle 2 kb; A destra, a valle 2 kb a 4 KB.
- Per ogni campione, dividere il conteggio di legge in ogni bin per il numero totale di combinati mappato letture calcolato 3.3.3. La normalizzazione eliminerà la specifica del campione leggere differenze e permette di confrontare la legge attraverso diversi campioni.
- Eseguire lo script bash (come indicato nel file script) per eseguire test statistico sul normalizzato letture ottenuti nella regione sinistra, per individuare metilazione differenziale tra normale e cassa gruppo nelle regioni descritti come nella regione del fianco.
Nota: Vedere il file di codifica supplementare per lo script bash. Sulla base delle regioni che sono differenzialmente metilati, vi sono sette combinazioni:
Tutta la regione: metilazione differenziale in tutta la TSS ± regione 4 kb
middleLeft: differenziale metilazione sia in regione centrale e di sinistra
MiddleRight: differenziale metilazione nella regione sia centro e destra
Fianco: differenziale metilazione sia in regione a destra ea sinistra
A sinistra: metilazione differenziale nella regione solo a sinistra
A destra: differenziale metilazione nella regione solo a destra
Medio: differenziale metilazione nella regione centrale solo - Utilizzare lo stesso script bash per visualizzare la metilazione differenziale in una trama tornado. Tracciare le iper e ipo geni metilati su un pannello separato, e ordinare nell'ordine della combinazione regione come descritto in 3.4, rispettivamente.
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Representative Results
Abbiamo usato MBDCap-seq per studiare alterazioni di metilazione del DNA in un gran numero di pazienti da diversi tipi di cancro compresi seno 12, dell'endometrio 13, prostata 14, e tumori del fegato, tra gli altri. Qui mostriamo alcune informazioni dallo studio del cancro al seno pubblicato di recente 12. In questo caso, abbiamo utilizzato l'intero approccio di sequenziamento del genoma per identificare isole CpG che sono differenziale metilato nei tumori rispetto al normale nelle diverse regioni genomiche. L'inchiesta ha rivelato che su un totale indagato isole CpG situate a promotori di geni (n = 13.081), il 19,5% ha mostrato metilazione differenziale nei tumori rispetto al normale. Allo stesso modo, di 6.959 intragenica isole CpG, il 55,2% ha mostrato metilazione differenziale. Promotori intergenici hanno mostrato 28,1% del 4847 e per i promotori dei geni senza isole CpG, 1,8% di 5.454 regioni indagate mostrato differenziale metilazione del DNA (Figura 1A). Una rappresentazione visiva(Figura 1B) mostra esempi rappresentativi delle regioni sopra discussi. La mappa termica descrive chiaramente le regioni metilato attraverso 77 tumori del seno, del seno 10 tessuti normali, e le linee di cellule di cancro al seno 38. La quantificazione della metilazione come discusso nel protocollo bioinformatica dettagliato in questo manoscritto, ci permette di eseguire vari test statistici attraverso questi campioni dei pazienti per identificare le differenze di metilazione significative in tutta la popolazione o di una sottopopolazione. Questo approccio di analisi ci fornisce obiettivi verificabili per approfondire i meccanismi epigenetici in questi campioni di pazienti. Una volta che questi obiettivi sono stati identificati, i livelli di metilazione possono essere ulteriormente quantificati e validati con pirosequenziamento. Il MBDCap-Seq offre una risoluzione genomica di circa 100-200 bp per i target. Per ottenere ulteriori risoluzione, singole sedi CpG all'interno di queste regioni possono essere selezionati per la quantificazione pirosequenziamento. Usiamo questo approccio Quanviduare e convalidare le differenze di metilazione osservate nei dati MBDCap-Seq ad una risoluzione maggiore e per il confronto tra i singoli gruppi di pazienti. La Figura 2 mostra la quantificazione di metilazione in 2 sottogruppi cancro dell'endometrio non ricorrente (NR) rispetto al ricorrente (R). La figura illustra il livello di metilazione del DNA per ogni paziente nei 2 gruppi a diversi siti CpG nel promotore CpG isola del SFRP1 gene target individuato.
Figura 1:. Hypermethylation DNA in campioni di cancro al seno rispetto al normale tessuto mammario in promotore e non promotore CpG isole cattura metile sequenziamento (MBD-ss) è stato utilizzato per generare profili di metilazione del DNA dei genomi di tumori al seno (n = 77) e tessuto mammario normale (n = 10). (A) Pie grafici dimostrano differenziale metilazione nel promotore, intragenica, e intergenic CGI, nonché regioni promotrici non CGI. (B) Esempio loci che mostra CGI promotore, intragenica, intergenica e regioni promotrici non CGI. Piazze tratteggiate evidenziano quelle corrispondenti al hypermethylation il cancro al seno. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Quantificazione di metilazione del DNA utilizzando pirosequenziamento di siti CpG in un gene bersaglio identificati metilazione del DNA di SFRP 5 regione del promotore di ricorrenti e non ricorrenti pazienti con carcinoma endometriale rilevati da pirosequenziamento.. Ogni sito rappresenta un sito CpG (R: ricorrenti, n = 21 e NR: non ricorrenti, n = 71). I grafici mostranole barre di media e di errore indicano l'errore standard della media e SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La tecnica MBDCap-seq è un approccio arricchimento affinità 3, considerata un'alternativa economica nell'ambito delle indagini coorti con un grande numero di pazienti 15. Il gasdotto presentato qui descrive un approccio globale da approvvigionamento di esempio per l'analisi e l'interpretazione dei dati. Uno dei passi più importanti è la creazione di una procedura di amplificazione PCR per migliorare l'efficienza della PCR delle regioni GC arricchito nel genoma come questo è dove si verifica la metilazione del DNA. Inoltre, è essenziale per garantire che dopo il sequenziamento, ogni campione è almeno più di 20 milioni mappata univocamente letture al genoma. Questa copertura si prevede di fornire sufficienti arricchimento o la sequenza di profondità per mappare l'intero genoma 12. Se questa copertura non è soddisfatta durante il primo turno di sequenziamento per un campione particolare e più di DNA per quel campione da parte uno è disponibile, un altro giro di sequenziamento nella seconda parte può essere eseguito. La risultante si legge può essere fusa con la rEADS dal primo turno per ottenere la copertura. Gli esperimenti globali devono essere progettati per includere alcuni controlli biologici (ad esempio, il tessuto normale) per tenere conto di pregiudizi in base a fattori come le variazioni copia-numero 15.
Il nostro approccio bioinformatica per studiare la metilazione del DNA osservato nei campioni dei pazienti fornisce possibili geni bersaglio che mostrano differenziale metilazione arricchimento nucleo promotore, regioni puntello promotore e anche varie combinazioni di questi. Nonostante il fatto che MBDCap-seq può al massimo raggiungere la risoluzione fino solo fino ad un 100 bp, la distinzione di queste regioni nel core e riva come descritto nel protocollo permette di identificare potenziali regioni target per ulteriori indagini dei ruoli normativi di differenziale arricchimenti metilazione e condurre i futuri studi meccanicistici. Qui abbiamo anche descritto un modo per visualizzare queste regioni identificate utilizzando tornado trame, che fornisce una panoramica della arricchimento differenzialemodelli.
Ci sono altre tecniche che si basano sulla conversione chimica della citosina non metilato di uracile da bisulfide sodio attraverso deaminazione, e forniscono una copertura più completa di metilazione del DNA in una sola risoluzione nucleotide. Di solito dopo la conversione bisulfide, il DNA viene sequenziato usando pirosequenziamento per gli esperimenti di obiettivi o per intero genoma shotgun bisulfide sequenziamento (BS-ss). Queste tecniche riguardano la limitazione della tecnica descritto qui come MBDCap-seq può raggiungere solo al massimo una risoluzione fino a 100 bp. Tuttavia, nonostante questi approcci essendo più completa, sono relativamente costosi e possono aumentare esponenzialmente il costo come la profondità di sequenziamento o il numero di pazienti è aumentato. D'altra parte, piattaforme microarray bisulfide comunemente usati sono convenienti, ma offrono copertura relativamente bassa con sonde studiando le regioni vicine promotori genici anziché l'intero genoma. MBDCap-ss tuttavia, fornisceun equilibrio tra queste tecniche di sequenziamento ad alto costo e array di metilazione a basso costo 16. Stiamo usando questo protocollo per studiare la metilazione del DNA in un gran numero di coorti di pazienti, come parte del progetto Cancer Methylome sistema 10 e può essere utilizzato in studi futuri che coinvolgono grandi coorti di pazienti.
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Disclosures
Questo protocollo è stato sviluppato nei laboratori del Dr. Tim Huang e il Dr. Victor Jin presso l'Università del Texas Health Science Center a San Antonio.
Acknowledgments
Il lavoro è sostenuto da CPRIT Research Training Award RP140105, così come in parte sostenuto da Stati Uniti National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R01 GM114142 e da William & Ella Owens Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3 M sodium acetate, pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100 mL |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
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