Möss producerar en komplex multisyllabisk repertoar av ultraljudsvokaliseringar (USV). Dessa USVs används ofta som readouts för neuropsykiatriska störningar. Detta protokoll beskriver några av de metoder vi lärde oss och utvecklade för att konsekvent inducera, samla in och analysera de akustiska funktionerna och syntaxen hos muslåtar.
Möss producerar ultraljud vocalizations (USV) i en mängd olika sociala sammanhang under utveckling och vuxen ålder. Dessa USVs används för morpopulation 1 , ungdomsinteraktioner 2 , motsatta och samma könsinteraktioner 3 , 4 , 5 och territoriella interaktioner 6 . Under årtionden har amerikanerna använts av utredare som proxies för att studera neuropsykiatriska och utvecklings- eller beteendestörningar 7 , 8 , 9 och mer nyligen för att förstå mekanismer och utveckling av vokalkommunikation bland ryggradsdjur 10 . Inom de sexuella interaktionerna producerar vuxna manliga möss USV-låtar, som har vissa funktioner som liknar låtfåglar 11 . Användningen av en sådan multisyllabisk reperToires kan öka den potentiella flexibiliteten och informationen de bär, eftersom de kan varieras i hur element organiseras och rekombineras, nämligen syntax. I detta protokoll beskrivs en tillförlitlig metod för att framkalla USV-sånger från manliga möss i olika sociala sammanhang, såsom exponering för fräsch kvinnlig urin, bedövade djur och estrushunner. Detta inkluderar villkor för att inducera en stor mängd stavelser från mössen. Vi minskar inspelningen av omgivande ljud med billiga ljudkammare och presenterar en kvantifieringsmetod för att automatiskt detektera, klassificera och analysera USV. Den senare innefattar utvärdering av samtal, vokalrepertoar, akustiska parametrar och syntax. Olika sätt och insikter på att använda uppspelningar för att studera ett djurs preferens för specifika sångtyper beskrivs. Dessa metoder användes för att beskriva akustiska och syntaxförändringar över olika sammanhang hos hanmöss och låtpreferenser hos kvinnliga möss.
I förhållande till människor producerar möss både låg- och högfrekvensvokaliseringar, de senare kallas ultraljudsvokaliseringar (USVs) ovanför vårt hörselområde. USV: erna produceras i en mängd olika sammanhang, däribland från mor-pup-hämtning, ungdomsinteraktioner, mot vuxna interaktioner eller motsatta könsrelaterade interaktioner 4 , 12 . Dessa USVs består av en mångsidig multisyllabisk repertoar som kan kategoriseras manuellt 9 eller automatiskt 10 , 11 . Dessa USV: s roll i kommunikationen har varit under ökad utredning de senaste åren. Dessa inkluderar att använda USVs som utläsningar av musmodeller av neuropsykiatriska, utvecklings- eller beteendestörningar 7 , 8 och interna motivations- / emotionella tillstånd 13 . USVs menas att förmedla tillförlitlig information på eMitters tillstånd som är användbart för mottagaren 14 , 15 .
Under 2005, Heliga och Guo 11 , avancerade tanken att vuxna manliga möss USVs organiserades som en följd av multisyllabiska samtalselement eller stavelser som liknar sångfåglar. I många arter tillåter en multisyllabisk repertoar emitteren att kombinera och beställa stavelser på olika sätt för att öka den potentiella informationen som bärs av låten. Variation i denna syntax antas ha en etologisk relevans för sexuellt beteende och kompispreferenser 16 , 17 . Efterföljande studier visade att manliga möss kunde ändra den relativa sammansättningen av stavelsetyper de producerar före, under och efter närvaron av en kvinna 5 , 18 . Det vill säga, de vuxna hanmöserna använder sina USVs för domstolsbeteende, antingen för att locka till sigEller upprätthålla nära kontakt med en kvinna eller för att underlätta parningen 19 , 20 , 21 . De emitteras också i man-man-interaktioner, förmodligen förmedla social information under interaktioner 4 . För att fånga dessa förändringar i repertoarer mäter vetenskapsmän vanligtvis spektralfunktionerna (akustiska parametrar, såsom amplitud, frekvenser etc. ), antal USVs stavelser eller samtal och latens till första USV. Men få ser faktiskt på sekvensdynamiken hos dessa USVs i detalj 22 . Nyligen har vår grupp utvecklat en ny metod för att mäta dynamiska förändringar i USV-stavelsekvenserna 23 . Vi visade att stavelsesordningen i en sång om (nämligen syntax) inte är slumpmässig, att den ändras beroende på det sociala sammanhanget och att de lyssnade djuren upptäcker dessa förändringar som etologiskt relevanta.
Vi noterar thHos många utredare som studerar djurkommunikation bifogar inte termen "syntax" samma exakta mening som syntax som används i mänskligt tal. För djurkommunikationsstudier menar vi helt enkelt en ordnad, icke-slumpmässig, ljudsekvens med vissa regler. För människor är dessutom specifika sekvenser kända att ha specifika betydelser. Vi vet inte om det här är fallet för möss.
I det här dokumentet och tillhörande video strävar vi efter att tillhandahålla tillförlitliga protokoll för att spela in manliga mössens USV-förhör i olika sammanhang och utföra uppspelningar. Användningen av tre sekventiellt använda programvara för: 1) automatiska inspelningar; 2) stavelse detektering och kodning; Och 3) en djupgående analys av stavelsegenskaper och syntax visas ( Figur 1 ). Detta gör det möjligt för oss att lära oss mer om manliga möss USV struktur och funktion. Vi tror att sådana metoder underlättar dataanalyser och kan öppna nya horisonter för att karakterisera normal och onormal vokal kommunikation i mouSe modeller av kommunikations- och neuropsykiatriska störningar.
Detta protokoll tillhandahåller tillvägagångssätt för att samla in, kvantifiera och studera manliga mössdomstolar i laboratoriet över en rad mestadels kvinnliga relaterade stimuli. Såsom presenteras tidigare i Chabout et al. 23 och i de representativa resultaten fick användningen av denna metod oss att upptäcka kontextberoende vokaliseringar och syntax som är viktiga för de mottagande kvinnorna. Standardiseringen av dessa stimuli kommer att ge insamling av ett tillförlitligt antal USV och möjliggöra detaljerade analyser av manens courtship-låtar och repertoarer.
När en levande kvinna är närvarande med mannen, tillåter protokollet inte oss att tydligt identifiera sändaren av vokaliseringen. Tidigare studier visade emellertid att majoriteten av vokaliseringen emitterades i detta sammanhang var av mannen 26 , 29 . De flesta studierna använder en speciell (man eller kvinna)Som en stimulans för männen tror att mängden kvinnlig vokaliseringar i dessa sammanhang är försumbar 4 , 5 , 22 , 30 . Emellertid använde en nyligen använt papper triangulering för att lokalisera vocaliseringen av emitteren i grupphusförhållanden 31 och visade att kvinnan inom en dyad bidrar till ~ 10% av USV: erna. I det föreliggande protokollet tillåter användningen av den bedövade kvinnan användaren att studera manliga vokaliseringarna i närvaro av en kvinna utan hennes vocalizing. Till skillnad från förväntningarna i den här nya studien 31 fann vi ingen skillnad i antalet stavelser emitterade mellan FE och AF-förhållandena 23 . Det är möjligt att levande kvinnor inte bidragit avsevärt till inspelningarna eller att männen vocalized mindre i närvaro av levande honor jämfört med anestesierad female. Trots detta tror vi att framtida experiment bör överväga användningen av denna trianguleringsmetod för att bedöma den potentiella effekten av kvinnans bidrag.
Det finns annan programvara tillgänglig som kan göra några steg som vi har skisserat, även om vi inte tror på det sätt som är tillräckligt för de frågor som vi frågade med en kombination av tre program: Software A, Mouse Song Analyzer programvara C med hjälp av programvara B, Syntaxanalysprogramvara med hjälp av D + E-beräkningar av kalkylarksprogram och syntaxdekorator med R. Exempelvis presenterade ett nyligen publicerat program en programvara med namnet VoICE som tillåter användaren att automatiskt extrahera akustiska variabler från sonogrammen eller direkt på enheter som hade blivit manuella Vald av användaren 32 . Men de automatiserade eller halvautomatiska sekvensanalyserna är inte lika detaljerade som vår metod. Vissa kommersiella program kan automatiskt analysera de akustiska funktionerna, men ger inte en automAtisk klassificering av stavelserna Användaren måste sortera de olika stavelserna efteråt. Grimsley, Gadziola, et al. 33 utvecklade ett tabellbaserat virtuellt mus vocal organprogram som kluster stavelser baserat på delade akustiska funktioner, men ger inte automatisk detektering av stavelserna. Deras program 34 är unikt genom att det skapar nya sekvenser från inspelade låtar med hjälp av Markov-modeller, och har därmed mer avancerade funktioner än enkel redigering.
De flesta tidigare kommunikationsstudier på möss har fokuserat på emitterens sidor 35 , 36 . Få studier har undersökt mottagarens sida 30 , 37 , 38 . Uppspelnings- och diskrimineringsprotokoll ger ett enkelt test för att studera mottagarens sida, som den som nyligen beskrivits av Asaba, Kato, etal. 39 . I den studien använde författarna en dubbelvalstestbox separerad med akustiskt skum istället för den Y-labyrint som beskrivs här. Båda valinställningarna har fördelar och nackdelar. För det första isolerar Y-labyrinten inte ljudet från en arm till den andra, men tvåvalskassen gör det. Men med hjälp av Y-labyrinten kan djuret snabbt utvärdera de två låtarna som spelas samtidigt och flytta mot den föredragna. Icke desto mindre bestämmer uppspelningsexperiment i allmänhet experimentera betydelsen och därmed funktionerna hos vokalisationerna som genereras för specifika djur. Sammanfattningsvis bör läsarna, efter att ha mastrat teknikerna för detta protokoll och analyser, kunna hantera många frågor som påverkar mus USVs kontext, genetik och neurobiologi.
Med hjälp av B6D2F1 / J-möss utlöser kvinnliga associerade stimuli nästan alltid USVs från de män som vi testat i vårt laboratorium. Det är kritiskt för kollegaenCt nog stavelser (> 100 i 5 min) för att kunna få en stark statistisk analys. För felsökning, om inga USV-filer spelas in (eller inte tillräckligt), kontrollera konfigurationen så att ljuden spelas in. Gör en levande inspektion av vad som händer i buret under inspelningen genom att titta på realtidssonogrammet på datorskärmen efter introduktionen av stimulansen. Annars försöker du återställa mannen till en sexuellt mogen / mottaglig kvinna över natten och sedan placera dem ensamma i flera dagar eller upp till en vecka innan du spelar in igen. Baserat på anekdotiska observationer finner vi att vissa män sjunger mycket på en dag (för nästan hela 5 min), och inte mycket nästa dag, och sedan igen en dag. Vi vet inte orsaken till att sådana inom ämnesvariationen inträffar, men vi antar att det förmodligen är en motiverande eller säsongsbetonad för männen, och estrusstaten för kvinnlig urin. Om inga USV-inspelningar registreras, försök att registrera djuret på flera dagar för att hämta dessa variabla effekter. UnlIke i sångfåglar, har vi inte noterat öppna skillnader i antalet sånger baserat på tid på dagen. Vi finner att männen inte sjunger mycket (<100 stavelser på 5 min) innan de är 7 veckor gamla.
Detekteringsmetoderna som presenteras här kan extrahera tusentals stavelser och alla akustiska parametrar om några minuter. Men som en automatisk detekteringsmetod är den mycket känslig för bakgrundsbrus. Med hjälp av Mouse Song Analyzer-programvaran med bullriga inspelningar (till exempel från djur som spelats in med sängkläder) kan det krävas justering av detektionsgränsen för att ge större flexibilitet. Detta ökar dock antalet falska positiva stavelser och den automatiska detektering kan misslyckas. Under sådana omständigheter kan manuell kodning användas.
Som tidigare sagt är antalet, repertoarierna och latensen av vokaliseringar varierande varierande beroende på stammen, så man måste ändra parametrar (inspelningslängd,Stimulans, automatiserad stavelse detektering, etc. ) för vissa stammar för att säkerställa optiska inspelningar för statistiska analyser.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Howard Hughes Medical Institute fonder till EDJ. Vi tackar Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI – University Paris south XI – FRANCE) för att låna oss högtalarhårdvaran. Vi tackar också medlemmarna i Jarvis Lab för deras stöd, diskussioner, korrigeringar och kommentarer om detta arbete, särskilt Joshua Jones Macopson för hjälp med siffror och test. Vi tackar Dr. Gustavo Arriaga för hjälp med Mouse Song Analyzer-programvaran, uppgradering av den för oss till V1.3 och andra aspekter av detta protokoll. V1.0 av mjukvaran utvecklades av Holy and Guo, och v1.1 och v1.3 av Arriaga.
Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
plexiglas separation | home made | – | 4 x 13 cm plexiglas with 1cm holes |
Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
Y-maze | Home made | – | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
Tweezers | |||
Software | |||
Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | – | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_v1.3-2015-03-23.zip | |
Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis – in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http:// www.graphviz.org; | |
Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
Reagents | |||
Xylazine (20mg/ml) | Anased | – | |
Ketamine HCL (100mg/ml) | Henry Schein | #045822 | |
distilled water | |||
Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
Cotton tips | |||
Petri dish |