की प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग Intracellular वोल्टेज के लिए electrophysiological विधि<em> ड्रोसोफिला</em> फोटोरिसेप्टर और लाइट उत्तेजनाओं को इन्तेर्नयूरोंस<em> Vivo</em

Summary

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Abstract

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell’s receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator’s experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Introduction

फल मक्खी (ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर) परिसर आंख तंत्रिका की छवि नमूना और प्रसंस्करण के लिए फोटोरिसेप्टर और interneuron सरणियों के कार्यात्मक संगठन जांच के लिए एक महान मॉडल प्रणाली है, और पशुओं के दर्शन के लिए। प्रणाली सबसे पूरा तारों आरेख ^1,2 है और आनुवंशिक जोड़तोड़ और ^3-10 (उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात और समय-संकल्प का) सटीक तंत्रिका गतिविधि की निगरानी करने के लिए मिलनसार है।

ड्रोसोफिला आंख युक्त ~ 750 कदाचित नियमित लेंस से ढकी संरचनाओं ommatidia कहा जाता है, जो एक साथ एक मनोरम दृश्य क्षेत्र है कि उसके सिर के चारों ओर लगभग हर दिशा को शामिल किया उड़ प्रदान मॉड्यूलर है। आंख की प्राथमिक जानकारी के नमूने इकाइयों इसकी rhabdomeric फोटोरिसेप्टर ^7,8,11 हैं। प्रत्येक ommatidium आठ फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं (R1-R8), जो एक ही पहलू लेंस का हिस्सा है, लेकिन सात अलग अलग दिशाओं के लिए गठबंधन कर रहे होते हैं। नदीम बाहरी फोटोरिसेप्टर R1-R6 की गिरफ्तारीई नीले-हरे रंग की रोशनी के लिए सबसे अधिक संवेदनशील, भीतरी कोशिकाओं R7 और R8, जो एक दूसरे के और एक ही दिशा की ओर इशारा करने शीर्ष पर झूठ का वर्णक्रम संवेदनशीलता, प्रदर्शनी तीन विशिष्ट उपप्रकार: पीला, पीले और पृष्ठीय रिम क्षेत्र (नाटकीय) ^{12 15।}

चित्रा 1. ड्रोसोफिला आँखों के कार्यात्मक संगठन। (क) दो पहला ऑप्टिक गैन्ग्लिया, रेटिना और पटल, मक्खी आंख के अंदर ग्रे में डाला जाता है। रेटिना R1-R6 फोटोरिसेप्टर और पटल बड़े Monopolar कोशिकाओं (LMCS: एल 1-L3) आसानी से पारंपरिक तेज microelectrode रिकॉर्डिंग करने के लिए विवो में पहुंच रहे हैं। योजनाबद्ध इलेक्ट्रोड रेटिना में R1-R6 से रिकॉर्ड करने के लिए सामान्य पथ प्रकाश डाला गया। एक पथ पटल में LMCS से रिकॉर्ड करने के लिए समानांतर इलेक्ट्रोड में बदलाव करने के लिए छोड़ दिया है। (बी) लामिना retinotopically अंग की एक मैट्रिक्स हैized कारतूस, जिनमें से प्रत्येक न्यूरॉन्स कि दृश्य अंतरिक्ष में एक विशिष्ट छोटे से क्षेत्र से जानकारी प्रक्रियाओं के साथ पैक किया जाता है। तंत्रिका superposition के कारण, विभिन्न पड़ोसी ommatidia से छह फोटोरिसेप्टर एक ही पटल कारतूस करने के लिए उनके एक्सोन (R1-R6) भेजने के लिए, एल 1-L3 और एक amacrine सेल (एएम) को histaminergic उत्पादन synapses के गठन। (सी) R1-R6 अक्षतंतु टर्मिनल और (L4, L5, Lawf, सी 2, सी 3 और T1 सहित), अंदर एक पटल कारतूस जटिल है दृश्य इन्तेर्नयूरोंस के बीच तंत्रिका जानकारी के प्रसार। (डी) R1-R6 फोटोरिसेप्टर एक्सोन एल 2 और L4 Monopolar कोशिकाओं से synaptic फीडबैक प्राप्त करते हैं। (बी) और (सी) रिवेरा-अल्बा एट अल ² से संशोधित किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ड्रोसोफिला आंख तंत्रिका superposition प्रकार ^{16 वर्ष} की है। यह टी का मतलबपटल और मज्जा: टोपी पड़ोसी ommatidia सात से संबंधित आठ फोटोरिसेप्टर है, जो अंतरिक्ष में एक ही बिंदु पर देखो के तंत्रिका संकेतों, अगले दो neuropils में एक तंत्रिका कारतूस पर एक साथ जमा कर रहे हैं। छह बाहरी फोटोरिसेप्टर R1-R6 परियोजना पटल में तंत्रिका स्तंभों के लिए अपने अक्षतंतु टर्मिनलों (चित्रा 1), R7 और R8 कोशिकाओं को इस परत को बायपास और उनके मज्जा स्तंभ ^17-19 इसी के साथ synaptic संपर्क बनाने हैं। ये सटीक वायरिंग, मक्खी जल्दी दर्शन के retinotopic मानचित्रण के लिए तंत्रिका सब्सट्रेट का उत्पादन हर पटल (आंकड़े 1 ए सी) जिस और मज्जा स्तंभ (कारतूस) अंतरिक्ष में एक बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है।

पटल ^1,2,20 में और amacrine सेल (एएम): R1-R6 फोटोरिसेप्टर से प्रत्यक्ष आदानों बड़े Monopolar कोशिकाओं (एल 1, एल 2 और L3 LMCS) से प्राप्त कर रहे हैं। इनमें से एल 1 और एल 2 सबसे बड़ा कोशिकाओं, प्रमुख सूचना रास्ते (चित्रा -1) मध्यस्थता, whi हैंचर्चा का जवाब ऑन और ऑफ चलती किनारों, और इस तरह प्रस्ताव डिटेक्टर ^21,22 के कम्प्यूटेशनल आधार बनेगी। व्यवहार प्रयोगों चलता है कि मध्यवर्ती इसके विपरीत पर, दो रास्ते की सुविधा के विपरीत दिशाओं की गति धारणा: बैक-टू-सामने एल 1 और एल 2 कोशिकाओं ^23,24 में सामने से वापस। कनेक्टिविटी आगे निकलता है L4 न्यूरॉन्स पड़ोसी कारतूस ^25,26 के बीच पार्श्व संचार करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। पारस्परिक synapses ही में स्थित एल 2 और L4 कोशिकाओं और दो आसन्न कारतूस के बीच पाए गए। डाउनस्ट्रीम, प्रत्येक एल 2 सेल और उसके तीन जुड़े L4 कोशिकाओं को एक आम लक्ष्य को उनके axons परियोजना, मज्जा, जहां पड़ोसी कारतूस से जानकारी के लिए माना जाता है में Tm2 न्यूरॉन सामने से वापस गति ²⁷ के प्रसंस्करण के लिए एकीकृत किया जा सके। हालांकि एल 1 न्यूरॉन्स दोनों अंतराल जंक्शनों और synapses के माध्यम से ही कारतूस L2S से इनपुट प्राप्त करते हैं, वे सीधे L4S और इसलिए आसन्न पटल कारतूस से जुड़े नहीं हैं।

<pवर्ग = "jove_content"> R1-R6 फोटोरिसेप्टर एक्सोन के लिए Synaptic फीडबैक एल 2 / L4 सर्किट से संबंधित न्यूरॉन्स द्वारा ही प्रदान की जाती हैं लेकिन न एल 1 मार्ग ^1,2 (चित्रा -1)। नदीम ही कारतूस कनेक्शन R1 और R2 के लिए एल 2 से और L4 से R5 करने के लिए चुनिंदा हैं, सभी R1-R6 फोटोरिसेप्टर या तो की L4 या दोनों पड़ोसी कारतूस से synaptic प्रतिक्रिया प्राप्त करते हैं। इसके अलावा, वहाँ आर 1, आर 2, R4 और R5 करने बजे से मजबूत synaptic कनेक्शन हैं, और glia कोशिकाओं को भी synaptically नेटवर्क से जुड़े हैं और इस तरह की तंत्रिका छवि प्रसंस्करण ⁶ में भाग ले सकते हैं। अंत में, axonal अंतराल जंक्शनों, पड़ोसी R1-R6 और R6 और R7 / R8 के बीच फोटोरिसेप्टर पटल में जोड़ने, एक कारतूस ^14,20,28 में असममित जानकारी प्रतिनिधित्व और प्रसंस्करण के लिए योगदान करते हैं।

व्यक्तिगत फोटोरिसेप्टर और लगभग बरकरार ड्रोसोफिला में दृश्य इन्तेर्नयूरोंस से intracellular वोल्टेज रिकॉर्डिंग उच्च संकेत करने वाली शोर आर प्रदानउप millisecond संकल्प ^3,5,7-10,29, जो लॉग इन न्यूरॉन्स के बीच तेजी से तंत्रिका संगणना की भावना बनाने के लिए आवश्यक है पर Atio डेटा। 100 मिसे संकल्प – परिशुद्धता के इस स्तर मौजूदा ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक है, जो काफी noisier कर रहे हैं और आम तौर पर 10 से कम काम से असंभव है। इसके अलावा, क्योंकि इलेक्ट्रोड बहुत छोटे और तेज सुझाव दिया है, विधि सेल शरीर के लिए ही सीमित नहीं है, लेकिन छोटे सक्रिय तंत्रिका संरचनाओं से प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग प्रदान कर सकते हैं; ऐसे LMCS 'वृक्ष के समान पेड़ या फोटोरिसेप्टर एक्सोन, जो पैच दबाना इलेक्ट्रोड का बहुत बड़ा युक्तियाँ तक नहीं पहुँचा जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, विधि भी संरचनात्मक रूप से कम आक्रामक और सबसे पैच दबाना अनुप्रयोगों से भी हानिकारक है, और इसलिए कम से अध्ययन 'कोशिकाओं intracellular परिवेश और जानकारी नमूने प्रभावित करता है। इस प्रकार, पारंपरिक तेज microelectrode तकनीक योगदान दिया है, और तंत्रिका सूचनाओं में योगदान, मौलिक खोजों और मूल अंतर्दृष्टि पर रखउचित समय के पैमाने पर सूचना प्रसंस्करण; दृष्टि ^3-10 के बारे में हमारी समझ को यंत्रवत में सुधार।

यह लेख बताते हैं कि कैसे ड्रोसोफिला R1-R6 फोटोरिसेप्टर और LMCS से विवो intracellular रिकॉर्डिंग में Juusola प्रयोगशाला में प्रदर्शन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल, कैसे एक उपयुक्त इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग का निर्माण करने का वर्णन मक्खी तैयार है, और रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करेंगे। कुछ प्रतिनिधि डेटा प्रस्तुत किया जाता है, और कुछ सामान्य मुद्दों और संभावित समाधानों पर चर्चा की जाती है कि जब इस पद्धति का उपयोग सामना हो सकता है।

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल शेफील्ड विश्वविद्यालय और बीजिंग नॉर्मल यूनिवर्सिटी के सभी जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुरूप है। 1. अभिकर्मकों और उपकरण तैयारी रिकॉर्डिंग और प्रकाश उत्तेजना उपकरण सेटअप एक कमरे में विनियमित नमी के साथ एयर कंडीशनिंग है और अंधेरे रिकॉर्डिंग की स्थिति प्रदान करने के लिए इसका मतलब है कि में electrophysiological प्रयोगों प्रदर्शन के लिए कम से कम एक 2.5 x 2.5 मीटर रिकॉर्डिंग क्षेत्र का चयन करें। सुनिश्चित करें कि इस क्षेत्र में काफी बड़े आराम से एक फिट करने के लिए है: (i) 1 एक्स 1 मीटर कंपन अलगाव तालिका घरों कि रिग दो हंस गर्दन के साथ, stereomicroscope और एक ठंड प्रकाश स्रोत [उत्तेजना और रिकॉर्डिंग उपकरण उड़], सब एक के भीतर संलग्न बड़े> 180 सेमी लंबा फैराडे पिंजरे; (Ii) आवास के लिए एक 38U उपकरण रैक एक फ्लैट एलसीडी मॉनिटर, microelectrode एम्पलीफायर, एलईडी ड्राइवर, फिल्टर, तापमान नियंत्रण इकाई, oscilloscopes और अन्य आवश्यक बिजली के उपकरणों के साथ एक पर्सनल कंप्यूटर; और (iii)छोटे डेस्क और अन्वेषक के लिए एक कुर्सी। रिग तक इस तरह रेफ्रिजरेटर, सेंट्रीफ्यूज और लिफ्ट के रूप में विद्युत और यांत्रिक शोर स्रोतों से दूर रखें। वोल्टेज spikes साधन में होने वाली से रिग के बिजली के उपकरणों की रक्षा के लिए अलग तेजी से रक्षा का प्रयोग करें। आदर्श रूप में, अपने स्वयं के uninterruptible बिजली की आपूर्ति (यूपीएस बैटरी) के लिए रिग शोर को कम करने के लिए कनेक्ट। पीतल और काले रंग की प्लास्टिक (चित्रा 2) के बाहर एक शंक्वाकार मक्खी-धारक का निर्माण। उसके बाहरी रिम के संकुचन के लिए ~ 0.8 मिमी व्यास (एक ठेठ मक्खी छाती चौड़ाई मिलान) के साथ पीतल इकाई के माध्यम से एक छोटा सा गावदुम छेद ड्रिल। नोट: इस छेद मक्खी-धारक की नोक की ओर घटना के लिए इतना है कि एक बड़ा औसत ड्रोसोफिला, जो airflow के द्वारा नीचे से पेश किया जाता है, की तुलना में अटक कंधे गहरी शीर्ष रिम में मिल जाएगा की जरूरत है। बनायें और यंत्रवत् मजबूत, अभी तक सटीक, मक्खी उत्तेजना और रिकॉर्डिंग उपकरण (चित्रा 3) का निर्माण। बाहर का निर्माण ओएफ एल्यूमीनियम या पीतल (उच्च चालकता धातुओं) एक मक्खी तैयारी मंच पोल और इसके चारों ओर एक Cardan हाथ प्रणाली, एम्बेडेड बॉल बेयरिंग के साथ, चिकनी और सटीक एक्स, वाई-स्थिति और प्रकाश प्रोत्साहन का ताला प्रदान करने के लिए। नोट: यह एकीकृत समग्र डिजाइन यांत्रिक कंपन, जो अन्यथा अध्ययन कक्ष से बाहर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड टिप को बेदखल कर सकता है कम करता है। यह आगे synaptic सर्किट संगणना 9,30 आकलन करने के लिए, एक Peltier-तत्व आधारित करीबी पाश तापमान नियंत्रण प्रणाली शामिल कर सकते हैं, जांचकर्ताओं को सक्षम करने के इस तरह के shibire टीएस के रूप में तापमान के प्रति संवेदनशील आनुवंशिक निर्माणों उपयोग करने के लिए। तंत्र anodize या यह काला प्रकाश प्रोत्साहन तितर बितर करने के लिए कम से कम रंग। मक्खी उत्तेजना और विरोधी कंपन तालिका के breadboard पर रिकॉर्डिंग उपकरण को ठीक करें; M6-बोल्ट द्वारा उदाहरण के लिए, अपने मीट्रिक पेंच छेद का उपयोग कर। प्रयोगों के दौरान प्रकाश तितर बितर करने के लिए कम से कम काले कपड़े के साथ एक काले रंग की breadboard का प्रयोग करें या इसे कवर। पदोंn और ताला एक Cardan हाथ प्रणाली के केंद्र में एक खड़ी समायोज्य मक्खी तैयारी मंच ध्रुव (एक ताला पेंच का उपयोग)। इतना है कि प्रकाश स्रोत Cardan हाथ से जुड़ी त्रिज्यात मक्खी के सिर को अंक फ्लाई तैयारी की जगह मंच पोल पर (मक्खी-धारक के भीतर, चरण 2 देखें)। सुनिश्चित करें कि मक्खी आंखों के केंद्र (0 0) Cardan-हाथ की एक्स और वाई-कुल्हाड़ियों, इस के भीतर किसी भी मुद्दे पर सटीक एक्स, प्रकाश प्रोत्साहन के y स्थिति में सक्षम बनाता है के रूप में मक्खी के चौराहे की बात पर बिल्कुल है दृश्य क्षेत्र। नोट: यह कार्यक्षमता विशिष्ट आंख स्थानों के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं की प्रतिक्रिया गुण मानचित्रण के लिए आवश्यक है, जैसे, जब इस तरह के उज्ज्वल या तीव्र क्षेत्र के रूप में संरचनात्मक रूपांतरों, जो बढ़ती संवेदनशीलता या संकल्प को क्रमश: 31 दिखा सकते हैं के लिए electrophysiological साक्ष्य के लिए खोज। विरोधी कंपन मेज पर मक्खी उत्तेजना के पीछे stereomicroscope और रिकॉर्डिंग उपकरण माउंट इसलिएकि यह मक्खी आंख की सहज उच्च वृद्धि देखने प्रदान करता है। प्रकाश स्रोत के दोहरी सिर अर्द्ध कठोर gooseneck प्रकाश गाइड मक्खी तैयारी धारक की ओर इशारा करते हुए नीचे के साथ खुर्दबीन के शीर्ष पर ठंड प्रकाश स्रोत माउंट। आज़ादी जंगम दो बीम रोशनी जब मक्खी आंख में एक छोटे से खोलने के माध्यम से ड्राइविंग के लिए यह आसान रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड टिप कल्पना करने के लिए बनाता है। मक्खी उत्तेजना और रिकॉर्डिंग उपकरण के सही पक्ष पर एक उचित एक्स, वाई, जेड micromanipulator सेट (मोटे और ठीक) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और विरोधी कंपन मेज पर सिर चरण के लिए, देते हैं, M6-बोल्ट या चुंबकीय का उपयोग कर खड़ा है। नोट: Juusola प्रयोगशाला में, अलग अलग रिसाव manipulators से लैस कर रहे हैं; जानकारी के लिए सामग्री और अभिकर्मकों की तालिका देखें। ये सभी उच्च गुणवत्ता intracellular रिकॉर्डिंग प्रदान करते हैं। खड़ी समायोज्य च पर संदर्भ इलेक्ट्रोड धारक के लिए एक छोटा सा मैनुअल 3 अक्ष micromanipulator माउंटLy तैयारी मंच पोल। संदर्भ इलेक्ट्रोड ओरिएंट इतना है कि यह मक्खी तैयारी की ओर इशारा कर रहा है। विरोधी कंपन मेज के चारों ओर इस्पात पैनल के बाहर एक मुक्त खड़े प्रकाश परिरक्षित फैराडे पिंजरे का निर्माण, मक्खी उत्तेजना और रिकॉर्डिंग उपकरण आसपास के बाहर विद्युत चुम्बकीय हस्तक्षेप को रोकने के लिए। पिंजरे के सामने खुला छोड़ दो, प्रयोगों के लिए उड़ान भरने की तैयारी के परिवहन के लिए पहुँच प्रदान करते हैं। शोर और प्रकाश बाहर ढाल करने के मोर्चे पर काले कपड़े के पर्दे (कॉपर होने या एल्यूमीनियम जाल ग्राउंडिंग के लिए उन्हें अंदर प्रत्यारोपित) संलग्न। पिंजरे काले रंग की इंटीरियर रंग प्रकाश बिखराव को कम करने और मंजिल कंपन को रोकने के लिए पिंजरे के पैरों के बोल्ट के लिए। दो अलग-अलग कम पास फिल्टर (बेसल या समान) BNC-केबल का उपयोग कर के निवेशों के लिए वोल्टेज और उच्च प्रतिबाधा intracellular microelectrode एम्पलीफायर के वर्तमान outputs कनेक्ट करें। इसी तरह, ई-कनेक्टर blo की उचित चैनलों में फिल्टर outputs कनेक्टCKS / डाटा अधिग्रहण प्रणाली (डीए / ई कार्ड) के बोर्ड। आपूर्तिकर्ता मैनुअल के अनुसार विशेष केबल द्वारा एक पर्सनल कंप्यूटर में डीए / ई कार्ड (एस) से कनेक्ट। पर्सनल कंप्यूटर पर पसंद का डाटा अधिग्रहण प्रणाली के लिए उचित अधिग्रहण सॉफ्टवेयर स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि डाटा अधिग्रहण ड्राइवरों पर्सनल कंप्यूटर पर ऑपरेटिंग सिस्टम के साथ संगत कर रहे हैं। ग्राउंड विद्युत मक्खी उत्तेजना और रिकॉर्डिंग उपकरण, फैराडे पिंजरे, तांबा जाल (पर्दे के अंदर), माइक्रोस्कोप, micromanipulators, ठंड प्रकाश स्रोत, अपने सभी उपकरणों के साथ 38U उपकरण रैक (intracellular एम्पलीफायर, फिल्टर, तापमान नियंत्रण इकाई, पीसी और एलसीडी मॉनिटर आदि) उपकरण ग्राउंडिंग तार और M6 अंगूठी ग्राउंडिंग समाप्त होता है समेटना का उपयोग करके एक भी केन्द्रीय भूमि बात करने के लिए। परीक्षण करने के लिए कि सभी भागों में एक ही मैदान में हैं एक बिजली मल्टीमीटर का प्रयोग करें। नोट: सबसे अच्छा संभव कम शोर रिकॉर्डिंग की स्थिति को प्राप्त करने के लिए, ग्राउंडिंग विन्यास आम तौर पर इधर-उधर भिन्न होमीटर एक दूसरे से सेट-अप। यदि आवश्यक हो, केन्द्रीय भूमि बिंदु इमारत भूमि पर आगे कनेक्ट, और / या microelectrode एम्पलीफायर के केंद्रीय जमीन। वास्तविक electrophysiological प्रयोगों के दौरान पूरी तरह से कार्य प्रणाली के परीक्षण के बाद, के रूप में रिकॉर्डिंग में शोर को कम करने की जरूरत ग्राउंडिंग विन्यास को बदलने के लिए तैयार रहना। , संकेत छानने (आमतौर पर कम पास फिल्टर 500 हर्ट्ज है, जो दोनों R1-R6 और एलएमसी डेटा के लिए उपयुक्त है पर सेट), और नमूना दर (कम से कम 1 kHz) – सॉफ्टवेयर प्रवर्धन (10X 1) विन्यस्त करें। सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स का पालन करना Nyquist-शैनन नमूना प्रमेय 32; उदाहरण के लिए, जब डेटा है कि अधिग्रहण कम पास फ़िल्टर 500 हर्ट्ज पर, अलियासिंग प्रभाव को कम करने के लिए 1 किलो हर्ट्ज या अधिक की एक नमूना आवृत्ति का उपयोग करें। 65 एम वी, और LMCS 20 की उन – – R1-R6 फोटोरिसेप्टर की विशेषता वोल्टेज की प्रतिक्रियाएं 40 के रूप में 45 एम वी, प्रवर्धन की स्थापना की और प्रदर्शन के हिसाब से तराजू उच्च संकल्प sampli सक्षम करने के लिएएनजी और डेटा दृश्य। चित्रा 2. शंक्वाकार फ्लाई धारक मक्खी-धारक दो टुकड़े से बाहर कर दिया गया है। केंद्रीय पीतल इकाई और उसके शंक्वाकार काले प्लास्टिक कोट। पीतल इकाई के अंदर केंद्रीय छेद एक छोटे व्यास है कि मुश्किल के माध्यम से मक्खी की सुविधा देता है के लिए tapers। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3. Electrophysiological रिग का अवलोकन। सेट अप एक मुक्त खड़े प्रकाश परिरक्षित फैराडे पिंजरे, विरोधी कंपन मेज, मक्खी उत्तेजना और रिकॉर्डिंग उपकरण, और काले कपड़े के पर्दे कॉपर या के साथ शामिल करने के लिए अंदर एल्यूमीनियम जाल ग्राउंडिंग। आईएनएसtrument रैक विद्युत फैराडे पिंजरे के अंदर सभी उपकरणों के साथ ही केंद्रीय जमीन से जुड़ा है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। Microelectrodes fabricating filamented borosilicate से संदर्भ microelectrode खींचो (बाहरी व्यास: 1.0 मिमी, भीतरी व्यास 0.6 मिमी) या क्वार्ट्ज गिलास (बाहरी व्यास: 1.0 मिमी, भीतरी व्यास 0.5, 0.6 या 0.7 मिमी) एक पिपेट डांड़ी साधन का उपयोग कर ट्यूबिंग। एक छोटी क्रमिक घटना प्राप्त करने के लिए प्रयास करें। नोट: पिपेट डांड़ी कार्यक्रम की सटीक सेटिंग्स साधन के लिए साधन से भिन्न है; सामग्री और राज्य प्रतिनिधियों की तालिका में अधिक जानकारी। क्योंकि संदर्भ इलेक्ट्रोड की नोक मक्खी तैयारी में डाला जा रहा से पहले टूट जाएगा नोक पर ताकना आकार महत्वपूर्ण नहीं है। filamented borosilicate (बाहरी व्यास से रिकॉर्डिंग microelectrode खींचो: 1.0 मिमी, भीतरी व्यास 0.6 मिमी) या क्वार्ट्ज गिलास (बाहरी व्यास: 1.0 मिमी, भीतरी व्यास 0.5, 0.6 या 0.7 मिमी) एक पिपेट डांड़ी साधन का उपयोग कर ट्यूबिंग। ठीक क्रमिक शंकु – (15 मिमी 10) एक लंबे प्राप्त करने के लिए प्रयास करें। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप है कि रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सही गावदुम दिखाने के साथ निरीक्षण किया। moldable चिपकने के साथ एक गिलास स्लाइड पर इलेक्ट्रोड माउंट और अपनी टिप का निरीक्षण करने के लिए 40X हवा उद्देश्य का उपयोग करें। नोट: एक अच्छा इलेक्ट्रोड अपने अदृश्य छोटी सी टिप, जो चारों ओर निरंतर समानांतर गहरा और हल्का हस्तक्षेप पैटर्न देखा जा सकता है जब तक सुचारू रूप से tapers। कुछ खींचने सेटिंग्स उच्च प्रतिरोध इलेक्ट्रोड, जो सफल सेल पेनेट्रेशन उपज नहीं कर सकते हैं क्योंकि उनके सुझावों के समान "तुरहियां" उत्पन्न करते हैं। इस प्रकार, इलेक्ट्रोड का दृश्य निरीक्षण के लिए महत्वपूर्ण है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग को सुरक्षित रखने और परिवहन के लिए क्ले मॉडलिंग (या इसी तरह moldable चिपकने वाला) के साथ एक बड़े पेट्री डिश पर क्षैतिज इलेक्ट्रोड संलग्न। सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड सुझावों एकहवा में हमेशा से रहे हैं और गलती से कुछ भी छू नहीं। बैक भरने रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड सिर्फ उचित नमक के घोल के साथ प्रयोग करने से पहले। एक छोटे से 5 मिलीलीटर (जैसे एक microloader के रूप में) ठीक एक प्लास्टिक की टिप के साथ एक छोटे से कण फिल्टर से जुड़े सिरिंज का प्रयोग करें। फोटोरिसेप्टर प्रयोगों के लिए, 3 एम KCl के साथ पूर्ण जब तक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (अपने बड़े अंत में एक छोटी बूंद रूपों) को भरने के रूप में इस समाधान दर्ज की वोल्टेज के लिए तरल जंक्शन क्षमता के प्रभाव को कम करता है। histaminergic LMCS, जो क्लोराइड-प्रवाहकत्त्व परिवर्तन से R1-R6 फोटोरिसेप्टर से synaptic इनपुट का जवाब की जांच के लिए, 3 एम पोटेशियम एसीटेट और 0.5 मिमी KCl के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को भरने के रूप में इस समाधान सेल की क्लोराइड बैटरी पर कम प्रभाव पड़ता है। मक्खी घंटी के साथ संदर्भ इलेक्ट्रोड भरें, मिमी में युक्त: 120 NaCl, 5 KCl, 10 टीईएस (सी 6 एच 15 6 एस), 1.5 CaCl 2, 4 MgCl 2, और 30 सुक्रोज <s> 5 अप। रिकॉर्डिंग प्रणाली में एक नव खींच लिया रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध का परीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड धारकों के अंदर चांदी के तारों में समान रूप से चांदी क्लोराइड के साथ लेपित हैं (दिखने बैंगनी ग्रे – नहीं चमकदार चांदी) (जैसे जंक्शन क्षमता में बहाव के रूप में) रिकॉर्डिंग कलाकृतियों को कम करने के लिए। यदि नहीं, तो उन्हें ठीक से chloridized तारों के साथ बदलें। यदि आवश्यक हो, नए चांदी के तारों chloridize। ध्यान से तारों ताकि इन दिखाई रंग में उज्ज्वल चांदी (जल्दी से एक लौ के माध्यम से उन्हें पास करके) को साफ। , उंगलियों के साथ उन्हें छू क्रम में AgCl की एक भी परत पर जमा करने से बचें। 15 के लिए पूरी ताकत घरेलू ब्लीच में तारों भिगो दें – 30 मिनट तक वे बैंगनी ग्रे रंग दिखाई देते हैं। 15 सेकंड तक पर्याप्त रूप से लेपित – वैकल्पिक रूप से, 10 के लिए (यह एक समाधान 3 एम KCl युक्त करने के लिए सम्मान के साथ सकारात्मक रही है और 1 मा / सतह क्षेत्र के 2 सेमी की दर से यह माध्यम से एक मौजूदा गुजर द्वारा) प्रत्येक तार बिजली से। </lमैं> उनकी इलेक्ट्रोड धारकों को वापस भरे रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें। खड़ी समायोज्य मक्खी तैयारी मंच पोल पर एक छोटी सी घंटी समाधान स्नान रखें। घंटी समाधान में इलेक्ट्रोड सुझावों ड्राइव और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के टिप प्रतिरोध को मापने। नोट: जब इलेक्ट्रोड, जो कांच ट्यूबिंग का एक नया बैच, या जब चलना के माध्यम से microelectrode खींचने साधन कार्यक्रमों के अनुकूलन से खींच रहे हैं की प्रतिरोधक गुण का परीक्षण यह कदम केवल जरूरत है। प्रतिरोध माप प्रदर्शन से पहले, उचित माप सेटिंग्स के लिए एम्पलीफायर निर्माण के उपयोगकर्ता के मैनुअल में निर्देश पढ़ें। 220 MΩ – एक अच्छा रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए, ~ 100 के एक टिप प्रतिरोध किया है। 2. ड्रोसोफिला तैयारी 10 दिन पुरानी मक्खियों (eclosion के बाद) और उन्हें सेंट युक्त एक साफ मक्खी ट्यूब में जगह – 5 लीजिएAndard खाना। यह अच्छा रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए संभव है युवा भी मक्खियों से "नवजात शिशुओं" से भी; लेकिन क्योंकि उनके नरम आंखों की, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए एक कार्निया उद्घाटन काटने अधिक कठिन है। एक मक्खी पकड़ने ट्यूब और एक मक्खी तैयारी का निर्माण खड़े (चित्रा 4)। कैसे ये स्वयं बनाया औजार एक साथ डाल रहे थे के सामान्य विचार के लिए चित्रा 4 देखें। एक मक्खी पकड़ने ट्यूब बनाने के लिए, 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब के शंक्वाकार नीचे की नोक काट दिया। फिर, डालने और इस नए खोलने पर 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के बड़े अंत गोंद। अंत में, एक आकार है कि आसानी से एक मक्खी के माध्यम से चलने के लिए देता है पिपेट के छोटे अंत में कटौती। एक छोटी सी मक्खी तैयारी मंच है कि 2-कुल्हाड़ियों रोटेशन और विभिन्न पदों के लिए उड़ान भरने के धारक का ताला सक्षम बनाता है इकट्ठा करने के लिए एक यांत्रिक कार्यशाला से परामर्श करें। Figurई 4. उपकरण और Devises मक्खी तैयारी बनाने के लिए आवश्यक। उड़ना पकड़ने ट्यूब एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए एक 1 मिलीलीटर की प्लास्टिक विंदुक टिप gluing द्वारा किया जाता है। Bespoke मक्खी तैयारी स्टैंड मक्खी की तैयारी के लिए एक इच्छित स्थान में मुक्त रोटेशन और मक्खी-धारक का ताला सक्षम बनाता है। मक्खी मोम द्वारा तय हो गई है, बिजली के मोम-हीटर का उपयोग कर। पेट्रोलियम जेली एक छोटे से एक संभाल पर एक मोटी प्रकार बाल जोड़ने के द्वारा बनाया applicator के द्वारा लागू किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 1 मिलीलीटर विंदुक टिप, जो मुश्किल के माध्यम से फिट करने के लिए एक मक्खी के लिए सक्षम बनाता है में प्रयोग के लिए एक मक्खी लीजिए। मक्खी ट्यूब करने के लिए उस पर विंदुक टिप के साथ, मक्खी ट्यूब पकड़ने संलग्न करें। एक मक्खी को पकड़ने में ऊपर की तरफ विंदुक टिप में (antigravitaxis) चढ़ाई करने के लिए अपने निहित प्रवृत्ति का लाभ ले। अधिमानतः, आकार मामले के रूप में सबसे बड़ी महिला, चयनइलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में है। नोट: बड़ी मक्खी, बड़ा अपने कोशिकाओं और बेहतर उच्च गुणवत्ता intracellular रिकॉर्डिंग के लिए मौके। छोटे मक्खियों (दोनों महिलाओं और पुरुषों) भी उत्कृष्ट रिकॉर्डिंग प्रदान कर सकते हैं, लेकिन तैयारी बनाने के लिए और अधिक कठिन है। एक बार मक्खी एक बड़ी विंदुक टिप में फंस गया है, भागने से रोकने के लिए अन्य मक्खियों मक्खी ट्यूब बंद करने के लिए याद है। विंदुक टिप का बड़ा खोलने के लिए एक लचीला प्लास्टिक की नली के साथ एक 100 मिलीलीटर सिरिंज कनेक्ट – यह अभी भी मक्खी के साथ। बड़े विंदुक टिप, जो बस के माध्यम से एक ड्रोसोफिला जाने के लिए बढ़ा है पर संकीर्ण अंत की जगह फ्लाई धारक के तल में खोलने के लिए और मक्खी-धारक में मक्खी बेदखल करने के लिए सिरिंज से हवा की एक छोटी मात्रा निचोड़ । stereomicroscope के माध्यम से देखो और धीरे से अधिक हवा प्रशासन जब तक मक्खी के सिर मक्खी-धारक की शंक्वाकार अंत से फैला हुआ है। सुनिश्चित करें कि मक्खी मजबूती से छोटे ope को अपनी छाती से फंस गया हैनिंग मक्खी-धारक के शीर्ष पर। मक्खी-धारक को अपने "कंधे" से मोम के साथ उड़ दृढ़ करने के लिए एक मोम हीटर का प्रयोग करें। मोम हीटर के तापमान को समायोजित संभव के रूप में अभी तक सफाई से मोम के पिघलने के रूप में कम हो सकता है। नोट: जब तापमान सही है, मोम पारदर्शी प्रकट होता है। एक तापमान के बहुत उच्च मोम "दूर जला" बनाता है; बहुत कम मोम कठोर रहता है। जब मक्खी फिक्सिंग, सटीक और लंबे समय तक गर्मी जोखिम यह नुकसान हो सकता है के रूप में संक्षिप्त हो। प्रकाश-ठीक दंत गोंद का उपयोग कर यहां की सिफारिश नहीं है के रूप में अपने आवेदन भी धीमी है। चित्रा 5 में vivo प्रयोगों के लिए फ्लाई तैयारी। छोड़ दिया, एक ड्रोसोफिला के सिर मक्खी-धारक में सीधे तैनात है और गर्म किया जा के साथ उड़-धारक को अपनी सूंड, दाहिनी आंख और कंधे से तय हो गई हैeswax। ठीक है, एक छोटे से खोलने, आंख की बड़ी से बड़ी भाग में कट जाता है सिर्फ भूमध्य रेखा और केवल कुछ ही वापस छल्ली से दूर ommatidia ऊपर, एक तेज धार का उपयोग कर। कॉर्निया का एक टुकड़ा धीरे हटा दिया जाता है और छेद पेट्रोलियम जेली सूख से आंख को रोकने के लिए साथ बंद है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। मक्खी के सिर स्थिर। सूंड (चित्रा 5) और दाईं आंख के कोने में मोम लागू करें, कॉर्निया से परहेज है, और मक्खी-धारक को इन बातों से सिर को ठीक। एक माइक्रो चाकू का उत्पादन। दो ब्लेड धारकों के साथ एक गैर-स्टेनलेस स्टील razorblade दबाना / तोड़ने (दोनों फ्लैट पकड़ के साथ) और उसके तेज धार की एक छोटी सी पट्टी दरार। स्वास्थ्य और सुरक्षा के लिए, आंखों की सुरक्षा के लिए चश्मे का उपयोग करें (भले ही यह लगभग नामुमकिन है कि टुकड़े जब उस्तरा टूट रहा है रिकोषेट होता है)। आदर्श रूप में,एक तेज धार कि एक शिखर जैसा दिखता है उत्पादन। सुनिश्चित करें कि इस 'शिखर' मजबूती से ब्लेड धारक से जुड़ा हुआ है, लेकिन किसी भी खुद को चोट से बचने के लिए सावधान रहना! लगभग 4 में – – सूक्ष्म चाकू का प्रयोग, मक्खी की बाईं आंख में कुछ ommatidia के एक छोटे से खोलने आकार तैयार सिर्फ आंख की भूमध्य रेखा के ऊपर पृष्ठीय छल्ली से 5 ommatidia रिकॉर्डिंग microelectrode के लिए पारित होने के प्रदान करने के लिए। एक stereomicroscope के तहत प्रदर्शन, उच्च वृद्धि के साथ तैयारी को देखने। नोट: क्योंकि मक्खी आंख लोचदार और जांच करने के लिए प्रतिरोधक लगता है, छेद एक "शिखर" -knife के साथ सबसे अच्छा रास्ता है। काटने तकनीक काफी चुनौतीपूर्ण है, तो वीडियो प्रदर्शन करने के लिए करीब ध्यान देना। कुछ झुकाव में मक्खी-धारक (मक्खी तैयारी स्टैंड में) रखते हुए विच्छेदन आसान बना सकते हैं। प्रारंभ में, microsurgery जानने के लिए मुश्किल महसूस कर सकते हैं, लेकिन एक बार प्रतिबद्ध है, तंत्रिका अनुकूलन धीरे-धीरे अन्वेषक के 3 डी-धारणा और निपुणता को बेहतर बनाता है। आरनिकालें ध्यान से खोलने से कॉर्निया का छोटा सा टुकड़ा है कि बस कट गया था, नीचे रेटिना उजागर। तेजी से पेट्रोलियम जेली applicator के ठीक बाल का उपयोग पेट्रोलियम जेली के एक छोटे से बूँद के साथ आंखों में छेद को कवर किया। नोट: पेट्रोलियम जेली यहां कई भूमिकाओं में कार्य करता है। यह ऊतक निर्जलीकरण और Hemolymph कि डाला रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को तोड़ देगा की जमावट से बचाता है। यह भी संयोग से कोट microelectrode, इसके अंदर का समाई को कम करने। यह रिकॉर्डिंग प्रणाली की आवृत्ति प्रतिक्रिया इतनी दर्ज की तंत्रिका संकेतों का अस्थायी समाधान में सुधार कर सकते हैं। आंख के बाकी पर पेट्रोलियम जेली smearing के रूप में इस प्रकाशिकी blurs से बचें। 3. R1-R6 फोटोरिसेप्टर या LMCS से रिकॉर्डिंग जब (फैराडे पिंजरे या विरोधी कंपन तालिका के धातु की सतह को छूने से उदाहरण के लिए) microelectrode एम्पलीफायर ऑपरेटिंग हमेशा आधारित होना रूप में यह एक गलती से देने precludesसिर मंच है, जो circuitry नुकसान पहुंचा सकता है के लिए एक स्थिर प्रभारी हैैं। दो हंस गर्दन प्रकाश गाइड (चित्रा 6A) (फैराडे पिंजरे के अंदर ठंड प्रकाश स्रोत के साथ) द्वारा ऊपर से उड़ान भरने की तैयारी मंच पोल रोशन इतना है कि मक्खी-धारक बंद दृश्य नियंत्रण में पसंदीदा स्थान में पोल पर रखा जा सकता है । चित्रा 6 पोजिशनिंग फ्लाई धारक और प्रयोगों के लिए इलेक्ट्रोड (एबी) फ्लाई-धारक भी है कि एक Peltier तत्व (ए: केंद्र में सफेद गोल मंच) के माध्यम से तापमान नियंत्रण प्रदान करता है रिकॉर्डिंग मंच पर रखा गया है।। Cardan हाथ सटीक चारों ओर उड़ान भरने के लिए एक समान दूरी (एक्स, वाई-रोटेशन के माध्यम से) पर प्रकाश उत्तेजना की स्थिति, प्रकाश स्रोत (एक तरल या क्वार्टज फाइबर ऑप्टिक बंडल अंत) सीधे अपनी आंख की ओर इशारा करते के साथ सक्षम बनाता है। कहां से कई मेंआर रिसाव, प्रकाश उत्तेजना (रैखिक वर्तमान चालकों के साथ) या एक monochromator द्वारा एल ई डी द्वारा उत्पन्न होता है। इस प्रकार, उनके उत्तेजनाओं एक विशिष्ट (बैंड) पारित किया वर्णक्रमीय सामग्री, 300 के बीच का चयन किया ले – 740 एनएम और कवर 4 – 6 लॉग तीव्रता इकाई (सीमा के रूप में अलग तटस्थ घनत्व फिल्टर द्वारा तनु)। (ग) दो microelectrodes, अलग micromanipulators द्वारा नियंत्रित है, मक्खी के सिर में तैनात कर रहे हैं: संदर्भ इलेक्ट्रोड (ऊपर) ocelli के माध्यम से; रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (बाएं) बाईं आंख में छोटे से खोलने के माध्यम से। (डी) फोटोरिसेप्टर रिकॉर्डिंग की अधिकतम संख्या प्राप्त करने के लिए, रिकॉर्डिंग microelectrode छेद में संचालित है, सूंड-ocellus धुरी के समानांतर। इलेक्ट्रोड टिप प्रवेश और एक फोटोरिसेप्टर के लिए जवानों, स्वतंत्र रूप से घूर्णन योग्य प्रकाश स्रोत की स्थिति में जहां सेल एक दिया प्रकाश प्रोत्साहन के लिए अधिकतम वोल्टेज प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए तय हो गई है जब। अंतरिक्ष में इस बिंदु सेल के ग्रहणशील क्षेत्र के केंद्र में है। अगर मैं छेदछल्ली के करीब है, एलएमसी पेनेट्रेशन आगे इस एक ही इलेक्ट्रोड कोण (बाएं) के साथ प्राप्त किया जा सकता रहा है। छेद छल्ली से आगे है, तो एक और उपयोगी इलेक्ट्रोड दृष्टिकोण कोण एलएमसी रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए भी दिखाया गया है (दाएं)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। मक्खी-धारक (इसमें मक्खी के साथ!) मक्खी तैयारी मंच पोल पर माउंट। मक्खी-धारक को बारी बारी से इतना है कि मक्खी की बाईं आंख सीधे अन्वेषक (चित्रा 6B) का सामना करना पड़ रहा है। एक छोटे मोटे micromanipulator का उपयोग करते समय stereomicroscope (चित्रा 6C) के माध्यम से तैयारी के अवलोकन के सिर कैप्सूल में मक्खी occelli के माध्यम से धीरे कुंद संदर्भ इलेक्ट्रोड डालें। इलेक्ट्रोड को धक्का नहीं है भी गहरी, के रूप में इस मक्खी के मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, छाती के पीछे में संदर्भ इलेक्ट्रोड डालने। हमेशा की तरह, यह सुनिश्चित करें कि मक्खी हीथ का प्रतीत होता है (इसके एंटीना चलता रहता है) और उसके आंखों बरकरार हैं; गलती से क्षतिग्रस्त नहीं। तैयारी बेदाग से भी कम समय लग रहा है, प्रयोगों के लिए एक नए मक्खी तैयार करते हैं। पेट्रोलियम जेली के माध्यम से बाईं आंख में तेज रिकॉर्डिंग microelectrode ड्राइव पहले तैयार छोटे से खोलने को कवर किया। stereomicroscope में उच्च वृद्धि का प्रयोग करें और प्रकाश गाइड और फोकल हवाई जहाज़ कदम इतना है कि इलेक्ट्रोड टिप स्थान अपने reflectance पैटर्न से 3 डी में स्पष्ट हो जाता है। नोट: चित्रा 6D दिखाता है कि मक्खी के सिर फोटोरिसेप्टर और एलएमसी रिकॉर्डिंग के लिए (कोण रिकॉर्डिंग microelectrode आँख में प्रवेश करती है के संबंध में) को अलग ढंग से थोड़ा तैनात किया जाना चाहिए। इसे तोड़ने के बिना आंख में इलेक्ट्रोड ड्राइविंग प्रयोग के सबसे कठिन दौर है। इलेक्ट्रोड टिप आंखों में छोटे से खोलने, कॉर्निया मार याद करते हैं, यह आम तौर पर टूट जाता है। microelectrode एम्पलीफायर चालू करेंदोनों इलेक्ट्रोड एक बार मजबूती से मक्खी के शरीर के तरल पदार्थ के साथ बिजली के संपर्क में, तैयारी के अंदर हैं। ठंड प्रकाश स्रोत (फैराडे पिंजरे के अंदर) बंद करें और साधन से यह हाल चलाना। जमीन-पाश बिजली के शोर प्रेरित कम करने, और हंस-गर्दन प्रकाश गाइड दूर ले जाने के लिए इतना है कि Cardan हाथ प्रणाली स्वतंत्र रूप से चारों ओर उड़ान भरने के लिए ले जाया जा सकता है के लिए केंद्रीय भूमि पर अपने प्लग कनेक्ट करें। कमरे में रोशनी बंद कर यह सुनिश्चित करना है कि उड़ान भरने की तैयारी रिश्तेदार अंधकार में है। आंखों में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (एम्पलीफायर उपयोगकर्ता के मैनुअल में निर्देश के रूप में) के प्रतिरोध को मापने। 250 MΩ – इलेक्ट्रोड जिसमें प्रतिरोध 100 है केवल रिकॉर्डिंग का प्रयोग करें। नोट: यह <70 MΩ इलेक्ट्रोड द्वारा उच्च गुणवत्ता intracellular रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए लगभग असंभव है। अगर प्रतिरोध <80 MΩ है, यह है कि इलेक्ट्रोड टिप टूट गया है की संभावना है। इस मामले में, एम्पलीफायर बंद कर और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड बदल जाते हैं। एक बार जब इलेक्ट्रोडबदल दिया है और आंखों में, एम्पलीफायर पर स्विच अपने प्रतिरोध को मापने के लिए। कभी कभी, इलेक्ट्रोड टिप कुछ कतरे से अवरुद्ध हो सकता है क्योंकि यह ऊतक में प्रवेश करती है। यह एम्पलीफायर की कैपेसिटिव चर्चा और वर्तमान नाड़ी कार्यों का उपयोग करके remedied किया जा सकता है कि आम तौर पर स्पष्ट है कि यह तेजी से की प्रतिध्वनि या प्रतिकर्षण द्वारा। वर्तमान दबाना (सीसी) या पुल रिकॉर्डिंग मोड के लिए एम्पलीफायर सेट करें। बाहर रद्द रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच किसी भी मनमाने ढंग वोल्टेज अंतर है, के रूप में उन दोनों को अब विद्युत परस्पर बाह्य अंतरिक्ष में आराम कर रहे हैं, शून्य करने के लिए संकेत ऑफसेट (रिकॉर्डिंग वोल्टेज) की स्थापना करके। एम्पलीफायर के प्रदर्शन readout या एक आस्टसीलस्कप स्क्रीन का उपयोग संकेत ऑफसेट परिवर्तन का पालन करें। के लिए उड़ान भरने के लिए आंख 2-3 मिनट रुको डार्क अनुकूल। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड टिप धीरे-धीरे छोटे 0.1 करने के लिए 1 माइक्रोन कदम के साथ आंख में गहरी ड्राइव। एक रिमोट नियंत्रित micromanipulator या बी का एक्स-अक्ष पीजो-स्टेपर साथ यह मत करोY धीरे एक मैनुअल जोड़तोड़ के ठीक संकल्प घुंडी घूर्णन। संक्षिप्त के साथ उड़ आँख उत्तेजित (1 – 10 मिसे) प्रकाश चमक के रूप में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड ऊतक में उन्नत किया जा रहा है। नोट: रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड रेटिना में तैनात है और आंख कार्यों आम तौर पर, प्रत्येक प्रकाश फ्लैश वोल्टेज में एक संक्षिप्त और छोटी सी बूंद का कारण बन जाएगा, तो (0.2 – 5 एम वी hyperpolarization), electroretinogram (एर्ग) कहा जाता है। बाह्य अंतरिक्ष के क्षेत्र में यह बदलाव संभावित प्रकाश में रेटिना की कोशिकाओं 'सामूहिक प्रतिक्रिया के कारण होता है। हालांकि, एक बार इलेक्ट्रोड टिप पटल में प्रवेश करती है, LMCS पर बंद करने, एर्ग, पराजयों depolarizing प्रतिक्रियाओं दिखा। Cardan हाथ प्रणाली का उपयोग करके मक्खी आंख के आसपास प्रकाश स्रोत ले जाने और स्थिति जहां प्रकाश सबसे बड़ा एर्ग प्रतिक्रिया उदाहरण भी देते हैं। नोट: यह स्थिति दृश्य अंतरिक्ष में छोटे से क्षेत्र के निशान जहां फोटोरिसेप्टर (या LMCS), जो रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की नोक के बगल में स्थित हैं, उनके प्रकाश इनपुट नमूना। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ एक सेल घुसना। नोट: प्रवेश अनायास हो सकता है, या जब इलेक्ट्रोड है आगे सूक्ष्म कदम रखा। इसे आगे भी धीरे micromanipulator प्रणाली दोहन से या एम्पलीफायर की चर्चा-समारोह का उपयोग करके की जा सकती है; इन कार्यों के ऊतकों में इलेक्ट्रोड टिप resonate। इलेक्ट्रोड फोटोरिसेप्टर झिल्ली impales, इसके intracellular अंतरिक्ष, रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच वोल्टेज अंतर में प्रवेश अचानक बूँदें ~ -65 एम वी 0 एम वी से (-55 और एम वी -75 के बीच); एलएमसी पेनेट्रेशन के दौरान, जबकि इस ड्रॉप (-30 और एम वी -50) के बीच आम तौर पर कम है। ये वोल्टेज मतभेद दी कोशिकाओं की नकारात्मक आराम क्षमता का प्रतिनिधित्व करते हैं। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (अपने तीखेपन) और सेलुलर प्रक्रिया यह प्रवेश की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से वोल्टेज पढ़ने, विश्राम क्षमता को तेजी से या धीरे-धीरे स्थिर कर सकते हैं कोशिका झिल्ली के रूप मेंइलेक्ट्रोड की बाहरी परत के लिए जवानों। लेकिन अगर प्रवेश केवल आंशिक या गरीब है, इलेक्ट्रोड आम तौर पर दर्ज की संभावित चढ़ाई शून्य की ओर पीठ के साथ सेल से बाहर निकल जाता है। प्रवेश सेल के ग्रहणशील क्षेत्र के केंद्र स्थानीय बनाना जब इलेक्ट्रोड ठीक से बंद प्रकट होता है, स्थिर झिल्ली क्षमता (अंधेरे विश्राम क्षमता) दिखा। Cardan हाथ प्रणाली का उपयोग कर, दृश्य अंतरिक्ष, जहां प्रकाश फ्लैश सेल की अधिकतम वोल्टेज प्रतिक्रिया उदाहरण भी देते में बिंदु को खोजने के लिए, मक्खी आंख के आसपास चमकती रोशनी प्रोत्साहन ले जाएँ। Cardan हाथ लॉक जब प्रकाश प्रोत्साहन सीधे (कम अंक) का सामना करना पड़ता ग्रहणशील क्षेत्र केंद्र। नोट: अंधेरे में, ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर 40 के साथ उज्ज्वल प्रकाश दालों का जवाब – 65 एम वी depolarizing वोल्टेज प्रतिक्रियाओं 4,5, जबकि स्थिर एलएमसी रिकॉर्डिंग 20 से 45 एम वी hyperpolarizing 9,10,14 प्रतिक्रियाओं दिखा। Glia पेनेट्रेशन शायद ही कभी हो सकता है, <-80 एम वी आराम क्षमता और बहुत धीमी ने संकेतऔर छोटे (~ 5 एम वी) संतृप्त प्रकाश प्रेरित depolarizations। जैसे सफेद आँख 7 और cinnabar के रूप में विभिन्न आंख pigmentations, साथ ड्रोसोफिला में फोटोरिसेप्टर, जंगली प्रकार के लिए तुलनीय प्रतिक्रिया आकार दिखा। अध्ययन कक्ष में – (200 मिसे 100) वर्तमान दालों अपनी झिल्ली चार्ज के दौरान रिकॉर्डिंग कलाकृतियों को कम करने के लिए एम्पलीफायर के वर्तमान दबाना (सीसी) मोड का उपयोग करना, छोटे 0.1 एनए और संक्षिप्त इंजेक्शन लगाने के द्वारा रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के समाई क्षतिपूर्ति। नोट: इस महत्वपूर्ण प्रक्रिया है एम्पलीफायर उपयोगकर्ता के मैनुअल में विस्तार से समझाया है, और वास्तविक प्रयोगों से पहले एक बिजली सेल मॉडल के साथ अभ्यास किया जाना चाहिए। प्रकाश दालों और हित के अन्य उत्तेजनाओं, को रिकार्ड वोल्टेज प्रतिक्रियाओं (जैसे प्राकृतिक प्रकाश की तीव्रता समय श्रृंखला या यादृच्छिक विपरीत पैटर्न के रूप में) अलग-अलग सांख्यिकीय या भौतिक गुणों वाले। टेस्ट, उदाहरण के लिए, कैसे दर्ज की प्रतिक्रियाएं प्रकाश या अंधेरे-अनुकूलन के साथ बदलने के लिए। ध्यान दें: एक ली सही कर सकते हैंप्रकाश पथ 4,5 पर तटस्थ घनत्व फिल्टर जोड़कर चुने हुए तीव्रता का निरंतर प्रकाश द्वारा अध्ययन सेल GHT-अनुकूलन। वैकल्पिक रूप से, लंबे समय तक काले अनुकूलन के लिए बंद एक पूर्व निर्धारित समय के लिए प्रकाश प्रोत्साहन स्विच। रिकॉर्डिंग प्रणाली के यांत्रिक स्थिरता की वजह से, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की उच्च गुणवत्ता और तैयारी के intactness, स्थिर रिकॉर्डिंग की स्थिति कभी कभी कई घंटे के लिए पिछले कर सकते हैं। इस प्रकार, एक अच्छा दिन पर, यह संभव है एक एकल कोशिका से अलग आदत डाल शर्तों पर डेटा की एक बड़ी राशि जमा है। इलेक्ट्रोड सेल से बाहर निकल जाता है, दर्ज की प्रतिक्रियाएं कम और मतलब वोल्टेज शून्य दृष्टिकोण करने के लिए शुरू होता है। ध्यान से micromanipulator के ठीक एक्स अक्ष पर नियंत्रण के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड अग्रिम जब तक इलेक्ट्रोड संपर्क में आता है और अगले सेल प्रवेश (यह आमतौर निकटतम पड़ोसी तंत्रिका है)। y- या z अक्ष के साथ इलेक्ट्रोड हिलना मत के रूप में इन युद्धाभ्यास इलेक्ट्रोड के लिए बनाने के लिए "PL होगाऊतक ough "बग़ल में, आंख संरचनाओं को नुकसान पहुँचाए! नोट: एक अच्छा इलेक्ट्रोड और एक स्वस्थ तैयारी के साथ, एक कई घंटे की अवधि में ही मक्खी में (कई LMCS से लेकिन शायद ही कभी) कई फोटोरिसेप्टर से उच्च गुणवत्ता की प्रतिक्रियाएं रिकॉर्ड कर सकते हैं; कभी कभी, पूरे कार्य दिवस (> 8 घंटा) स्पष्ट संकेत गिरावट के बिना खत्म हो गया। समय समय पर ऐसी तारीख, जीनोटाइप, और दर्ज सेल प्रकार के रूप में, जानकारी की पहचान के साथ डेटा फ़ाइलों को बचाओ। डेटा है कि एक सफल रिकॉर्डिंग सत्र में एकत्र किया जा सकता की बड़ी राशि के कारण भविष्य में डेटा विश्लेषण के लिए एक प्रयोगशाला पुस्तक में अच्छा लिखित रिकॉर्ड रखने के लिए।

Representative Results

तेज microelectrode रिकॉर्डिंग विधि के रूप में यहाँ ड्रोसोफिला आंख के लिए अनुकूलित, मज़बूती से उन्हें 4,5,7,8,10,33 के बीच तंत्रिका जानकारी नमूना और रेटिना और पटल कोशिकाओं में प्रसंस्करण, और संचार यों इस्तेमाल किया जा सकता है। यह प्रयोग कर विभिन्न प्रकार के जंगली स्टॉक, म्यूटेंट या अनुवांशिक इंजीनियर मक्खी उपभेदों में एन्कोडिंग का अध्ययन करने के द्वारा, विधि अपने मूल्य को साबित किया है; न केवल एक उत्परिवर्तन, तापमान, आहार या चयनित अभिव्यक्ति 3,4,6,9,10,14,30,34 के प्रभाव को बढ़ाता में, लेकिन यह भी बदल दृश्य व्यवहार 14,34 के लिए यंत्रवत कारणों का खुलासा करने में। विधि भी अन्य कीट की तैयारी 35,36, neuroethological दृष्टि के अध्ययन को सशक्त बनाने के लिए आसानी से लागू है। अगले हम इसके सफल अनुप्रयोगों के कुछ उदाहरण का प्रदर्शन। चित्रा 7. वोल्टेज20 पर एक प्रकाश नाड़ी और करने के लिए एक मक्खी फल R1-R6 फोटोरिसेप्टर की प्रतिक्रियाओं 25 ओ सी क्योंकि तेज microelectrode पेनेट्रेशन अक्सर बहुत स्थिर रहे हैं, इस पर एक दिए गए प्रकाश प्रोत्साहन के लिए एक ही R1-R6 फोटोरिसेप्टर का वोल्टेज प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए संभव है वार्मिंग या मक्खी ठंडा करके अलग परिवेश तापमान। हमारे सेट अप में, मक्खी-धारक एक करीबी पाश Peltier-तत्व आधारित तापमान नियंत्रण प्रणाली पर रखा गया है। यह सेकंड में मक्खी के सिर के तापमान में परिवर्तन करने के लिए हमें सक्षम बनाता है। उच्च तापमान वोल्टेज प्रतिक्रियाओं को तेज करता है और विशेषतया (के रूप में लाल तीर द्वारा संकेत) R1-R6 फोटोरिसेप्टर की विश्राम क्षमता कम करती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। फोटोरिसेप्टर आउटपुट पर तापमान के प्रभाव का अध्ययन <p class="jove_content" fo:kखें-together.within-पेज = "1"> के साथ एक अच्छी तरह से बनाया गया है और कंपन-पृथक रिकॉर्डिंग प्रणाली, विधि वार्मिंग से एक व्यक्ति के सेल के तंत्रिका उत्पादन पर तापमान के प्रभाव को मापने या मक्खी ठंडा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दिए गए उदाहरण के लिए एक उज्जवल 10 मिसे लंबे पल्स, 20 और 25 ओ सी (चित्रा 7) में एक ही R1-R6 फोटोरिसेप्टर में दर्ज करने के लिए वोल्टेज प्रतिक्रियाओं से पता चलता है। के रूप में 4.9 से पहले मात्रा निर्धारित, वार्मिंग अंधेरे में एक फोटोरिसेप्टर के विश्राम क्षमता को कम करती है, और इसकी वोल्टेज प्रतिक्रियाओं accelerates। 8 चित्रा संकेतन प्रदर्शन एक फल मक्खी R1-R6 फोटोरिसेप्टर प्रकाश तीव्रता के साथ सुधार (ए) फोटोरिसेप्टर उत्पादन मंद (नीचे) और उज्ज्वल करने के लिए। (ऊपर; 10,000 बार उज्जवल प्रकाश) प्राकृतिक प्रकाश की तीव्रता समय ही microelectrode द्वारा दर्ज की श्रृंखला दोहराया20 ओ सी पर एक ही सेल में उज्ज्वल प्रोत्साहन के लिए उत्तर करने, बड़े होते हैं, क्योंकि वे अधिक नमूनों, प्राथमिक प्रतिक्रियाओं (समान है) फोटॉनों 4,5,7,8 को एकीकृत। (बी) के 20 लगातार एक-दूसरे के लंबे वोल्टेज प्रतिक्रियाओं आरोपित कर रहे हैं। अलग-अलग प्रतिक्रियाएं (हल्के भूरे रंग) अनुकूली प्रवृत्तियों के बाद लिया गया (ए में तीर) (ए में बिंदीदार बॉक्स) घट गया है। इसी प्रतिक्रिया साधन (संकेत) गहरा निशान हैं। संकेत और अलग-अलग प्रतिक्रियाओं के बीच अंतर शोर है। (सी) कोशिकाओं सिग्नल के लिए शोर अनुपात (SNR) मानक तरीकों का उपयोग कर 4,5,7,8 'संकेत प्रदर्शन रिकॉर्डिंग के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था'। फोटोरिसेप्टर उत्पादन '(20 हर्ट्ज पर निर्भर है, मंद ≥1 के बारे में 64 हर्ट्ज व्यापक SNR) मंद की तुलना में (उज्ज्वल ≥1, अप करने के लिए 84 हर्ट्ज उज्ज्वल उत्तेजना में विश्वसनीय सिगनल की सीमा SNR)' है, एस के साथignal करने वाली शोर अनुपात में काफी सुधार; SNR मंद अधिकतम = 87 SNR ब्राइट मैक्स के लिए = 1868 से। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। दोहराव उत्तेजना से अनुकूलन और तंत्रिका एन्कोडिंग का अध्ययन विधि, रेटिना और पटल संरचनाओं में अपेक्षाकृत कम नुकसान हो सकता है की noninvasiveness, यह विवो में उनके पास प्राकृतिक शारीरिक स्थिति में अलग तरह के प्रकाश उत्तेजनाओं को व्यक्ति की कोशिकाओं के संकेतन प्रदर्शन के अध्ययन के लिए आदर्श बनाता है। 8 से पता चलता है एक R1- की वोल्टेज प्रतिक्रियाओं चित्रा 20 ओ सी में एक मंद और उज्ज्वल दोहराया प्राकृतिक प्रकाश की तीव्रता समय श्रृंखला प्रोत्साहन के लिए R6 फोटोरिसेप्टर, जबकि 9 चित्रा </stronजी> 25 ओ सी पर एक और R1-R6 फोटोरिसेप्टर और एक एलएमसी एक अलग प्राकृतिक प्रोत्साहन के लिए की प्रतिक्रियाओं से पता चलता है पूर्व और postsynaptic रिकॉर्डिंग दो अलग मक्खियों से अलग से प्रदर्शन किया गया, क्योंकि एक ही मक्खी में दो तेज microelectrodes, रेटिना में एक और पटल में अन्य द्वारा एक साथ intracellular रिकॉर्डिंग भी व्यवहार्य 30 होना करने के लिए मुश्किल हो जाता है। 9 चित्रा वोल्टेज 25 ओ सी (ए) R1-R6 (ग्रे) और एलएमसी (काला) में दोहराया प्राकृतिक उत्तेजना के लिए एक मक्खी फल R1-R6 फोटोरिसेप्टर और एलएमसी के जवाब अलग मक्खियों से अलग microelectrodes द्वारा दर्ज outputs। (बी) पूरी तरह से प्रकाश अनुकूलित लगातार 20 पूर्व (ऊपर) और पोस्टअन्तर्ग्रथनी (नीचे) अलग-अलग प्रतिक्रियाओं के साथ ही प्राकृतिक प्रोत्साहन पैटर्न के लिए प्रतिक्रियाओं प्रकाश में दिखाया गया है एक ग्रेघ इसी प्रतिक्रिया साधन (संकेत) गहरा निशान के रूप में। संकेत और अलग-अलग प्रतिक्रियाओं के बीच अंतर शोर है। (सी) कोशिकाओं सिग्नल के लिए शोर अनुपात (SNR) 'संकेत प्रदर्शन रिकॉर्डिंग के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था'। एलएमसी उत्पादन '(आर ≥1, ऊपर 94 हर्ट्ज के लिए R1-R6 उत्पादन SNR) से (एलएमसी ≥1, 104 हर्ट्ज के लिए ऊपर विश्वसनीय संकेत के बारे में 10 हर्ट्ज व्यापक रेंज SNR)' है। दोनों संकेत करने वाली शोर अनुपात उच्च रहे हैं (SNR एलएमसी अधिकतम = 142, SNR आर अधिकतम = 752), और के रूप में रिकॉर्डिंग शोर कम था, अपने मतभेदों की कोशिकाओं के बीच वास्तविक एन्कोडिंग मतभेदों को प्रतिबिंबित। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा। प्रोत्साहन शुरुआत के बाद, रिकॉर्डिंग ठेठly तेजी से रुझान है कि काफी हद तक 5-6 सेकंड के भीतर कम आदत डाल दिखा। तब से, कोशिकाओं प्रत्येक 1 सेकंड लंबा उत्तेजना प्रस्तुति के लिए अत्यधिक संगत प्रतिक्रियाएं (प्रत्येक डॉटेड बॉक्स encloses इनमें से 20) का उत्पादन। प्रतिक्रियाओं के repeatability स्पष्ट हो जाता है जब इन आरोपित कर रहे हैं (चित्रा 8B और चित्रा 9B)। व्यक्ति की प्रतिक्रियाएं पतली ग्रे निशान हैं, और उनके मोटा गहरा ट्रेस मतलब है। जबकि तंत्रिका शोर मतलब है और प्रत्येक व्यक्ति की प्रतिक्रिया 4,5,9,37,38 के बीच का अंतर है इसका मतलब यह प्रतिक्रिया, तंत्रिका संकेत के रूप में लिया जाता है। आवृत्ति डोमेन में संबंधित संकेत करने वाली शोर अनुपात (चित्रा 8 और 9 चित्रा), बिजली स्पेक्ट्रा में संकेत और शोर डेटा हिस्सा फूरियर बदलने, और इसी मतलब शोर शक्ति स्पेक्ट्रम 4 के साथ मतलब संकेत शक्ति स्पेक्ट्रम विभाजित करके प्राप्त किया गया 5,9,37,38। दिलचस्प है, अधिकतम संकेत करने वाली शोर अनुपात ओएफ प्राकृतिक उत्तेजना के लिए दर्ज तंत्रिका outputs उच्च (100 – 1000) हैं, और बहुत कम रिकॉर्डिंग शोर के साथ सबसे अधिक स्थिर तैयारी में मूल्यों तक पहुँच सकते हैं >> 1,000 (जैसे, चित्रा 8 सी।)। सूचना यह भी है कि वार्मिंग कोशिकाओं फैलता 'विश्वसनीय की बैंडविड्थ संकेत 4 (SNR' ब्राइट ≥ 1); उदाहरण के लिए, आंकड़े 8 और 9 में दो R1-R6S के बीच सापेक्ष अंतर है, क्रमश: 10 हर्ट्ज (84 पर 20 ओ सी और 25 ओ सी में 94 हर्ट्ज) है। आगे शैनन समीकरण 32, का उपयोग करके या ट्रिपल एक्सट्रपलेशन विधि 39 के माध्यम से जवाब 'एन्ट्रापी और शोर एन्ट्रापी दरों के बीच अंतर की गणना के द्वारा इसके संकेत करने वाली शोर अनुपात से जानकारी हस्तांतरण की प्रत्येक कोशिका की दर का अनुमान कर सकते हैं। जानकारी सैद्धांतिक विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए, और उनके उपयोग और सीमाविशेष रूप से इस विधि के साथ पिछले प्रकाशनों 7,8,39 में दिए गए हैं रहा है। चित्रा 10 वोल्ट 19 ओ सी (ए) R1-R6 (ग्रे) और एलएमसी (काला) एक ही मक्खी से ही microelectrode द्वारा दर्ज outputs में दोहराया प्राकृतिक उत्तेजना के लिए एक खूनी फ्लाई R1-R6 फोटोरिसेप्टर और एलएमसी के जवाब; पहले और बाद में postsynaptically presynaptically, के रूप में इलेक्ट्रोड आंखों में उन्नत किया गया था। (बी) (ऊपर) 20 लगातार पूर्व और postsynaptic (नीचे) प्रतिक्रियाओं (हल्के भूरे रंग के निशान) एक ही प्राकृतिक प्रोत्साहन पैटर्न के लिए प्रारंभिक अनुकूलन (ए में बिंदीदार बॉक्स) के बाद कब्जा कर लिया गया। अपने मतलब, संकेतों (शीर्ष पर गहरा निशान) कर रहे हैं, जबकि अलग-अलग प्रतिक्रियाओं के लिए अपने संबंधित मतभेदों शोर दे। (सी) के लिए इसी Signaएल के लिए शोर अनुपात (SNR) के आंकड़े 8 और 9 में के रूप में गणना की गई। एलएमसी उत्पादन '(134 हर्ट्ज के लिए ऊपर आर मैक्स ≥1 एक 100 हर्ट्ज व्यापक SNR) R1-R6 उत्पादन की तुलना में (एलएमसी मैक्स ≥1, ऊपर 234 हर्ट्ज के लिए विश्वसनीय सिगनल की सीमा SNR)' के बारे में है। दोनों संकेत करने वाली शोर अनुपात उच्च रहे हैं (SNR एलएमसी अधिकतम = 137, SNR आर अधिकतम = 627), और उसी के रूप में microelectrode रिकॉर्डिंग में इस्तेमाल किया गया था, अपने मतभेदों को पूर्व और postsynaptic तंत्रिका outputs में वास्तविक अंतर दर्शाते हैं। ये परिणाम मतलब है कि रिकॉर्डिंग प्रणाली कम शोर था, और विश्लेषण पर इसके प्रभाव सीमांत था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। Neuroethological विजन अध्ययन </p> विधि को भी विभिन्न कीट प्रजातियों 7,8,35,36 के यौगिक आँखें (10 चित्रा) से पूर्व और postsynaptic वोल्टेज प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए, दृश्य सूचना संसाधन के तुलनात्मक अध्ययन से पता neuroethological की अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रस्तुत रिकॉर्डिंग सिस्टम के लिए, केवल आवश्यक अनुकूलन नई तैयारी धारकों, अध्ययन प्रजातियों के लिए एक उपयुक्त आकार खोलने के साथ प्रत्येक है। ये रिकॉर्डिंग अनुकरणीय एक महिला हत्यारा मक्खी (Coenosia attenuata) के रहने वाले हैं। वे एक R1-R6 फोटोरिसेप्टर और एलएमसी समान दोहराए प्रकाश उत्तेजना के intracellular वोल्टेज प्रतिक्रियाओं को दिखाने के रूप में चित्रा 9 में ड्रोसोफिला समकक्षों के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन 19 ओ सी पर इस मामले में, दोनों पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी डेटा एक ही मक्खी से दर्ज किए गए; एक के बाद एक ही रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (3 एम KCl से भरा) पहली पार्श्व पटल के माध्यम से आगे बढ़ने के साथ अन्य, इससे पहले दर्जललाट रेटिना हैैं। यहां तक कि कूलर तापमान पर – – 25 ओ सी, Coenosia डेटा पर ड्रोसोफिला डेटा की तुलना में तेजी से गतिशीलता के साथ प्रतिक्रियाओं से पता चलता है; विश्वसनीय संकेतन (संकेत करने वाली शोर अनुपात >> 1) एक व्यापक आवृत्ति रेंज पर की रेंज का विस्तार। प्राकृतिक उत्तेजनाओं के तंत्रिका एन्कोडिंग में इस तरह कार्यात्मक रूपांतरों Coenosia के हिंसक जीवन शैली 36 है, जो तेजी से हवाई शिकार व्यवहार प्राप्त करने के लिए उच्च परिशुद्धता spatiotemporal जानकारी की आवश्यकता के अनुरूप हैं।

Discussion

We have presented the basic key steps of how to use sharp conventional microelectrodes to record intracellular responses of R1-R6 photoreceptors and LMCs in intact fly eyes. This method has been optimized, together with bespoke hardware and software tools, over the last 18 years to provide high-quality long-lasting recordings to answer a wide range of experimental questions. By investing time and resources to construct robust and precise experimental set-ups, and to produce microelectrodes with favorable electrical properties, high-quality recordings can become the norm in any laboratory working on Drosophila visual neurophysiology. Whilst well-designed recording and light stimulation systems are important for swift execution of different experimental paradigms, there are three procedural steps that are even more critical to achieving successful recordings: (i) to make the fly preparation with minimal eye damage, (ii) to pull microelectrodes with the right electrical properties, and (iii) to drive the recording electrode into the eye without breaking its tip. Ultimately, to record meaningful data, the investigator has to understand the physical basis of electrophysiology and how to fabricate suitable microelectrodes for the targeted cell-types.

Therefore, the limitations of this technique are primarily set by the patience, experience and technical ability of the investigator. Because this technique can take a long time to master for small Drosophila cells, it is advisable for trainee electrophysiologists to first practice with larger insect eyes, such as the blowfly³⁶ or locust³⁵, using the same rig. Once performing high-quality intracellular recordings from the larger photoreceptors and interneurons becomes routine, it is time to move on to the Drosophila eye. Another limitation of the technique concerns cellular identification. Penetrated Drosophila cells can be loaded electrophoretically with dyes, including Lucifer yellow or neurobiotin. However, because of the small tip size of the microelectrodes, electrophoresis works less efficiently than with lower resistance electrodes, such as patch-electrodes. Furthermore, the dye-filled microelectrodes characteristically have less favorable electrical properties, making it much harder to record high-quality responses with them from Drosophila photoreceptors and LMCs.

A technical problem that occurs sometimes is unstable input signal, or a complete lack of it. This is often associated with the voltage signal being either constantly drifting or higher/lower than the amplifier’s recording range. On most occasions, this behavior is caused by the recording electrode being blocked (or its tip being too fine – having too high a resistance or intramural capacitance – to properly conduct fast signal changes). Although one can try to unblock the tip by buzzing the electrode capacitance, which sometimes works, often the situation is best resolved by simply changing the recording electrode. This may further require parameter adjustments in the microelectrode puller instrument to lower the tip resistance of the new electrodes. The electrode tip can also become blocked in preparations, for which it took too much time to cover the corneal hole by petroleum jelly. Prolonged air-contact can dry up the freshly exposed retinal tissue, turning its surface layer into a glue-like substance. If this is the case, the investigator typically sees a red blob of tissue stuck on the recording electrode when pulling it out of the eye. The only solution here is to make a new preparation. Petroleum jelly may provide many benefits for electrophysiological recordings: (i) it prevents the coagulation of the hemolymph that could break the electrode tip; (ii) it coats the electrode tip reducing its intramural capacitance, which lowers the electrode’s time constant, and thus has the potential to improve the temporal resolution of the recorded neural signals^40,41; (iii) it keeps the electrode tip clean, facilitating penetrations; and after penetration, (iv) it may even help to seal the electrode tip to the cell membrane⁴².

The signal can further be unstable or lost when the silver-chloride wire of the electrode-holder is broken or dechloridized; in which case just replace or rechloridize the old wire. The missing signal can also result from one (or both) of the electrode-holders not being securely connected to their jacks. However, it is extremely unusual that a piece of equipment would be malfunctioning. If signal is undetectable and all other possibilities have been exhausted, test that each part of the recording apparatus, including the headstage, amplifier, low-pass filters and AD/DA-converters, are connected properly and functioning normally. One way to achieve this is to replace each instrument with another from a rig that is known to operate normally. Alternatively, use a signal generator to check the performance of the electronic components one by one.

But perhaps the most common technical problem facing the electrophysiologist is that of recording noise. Broadly, recording noise is the observed electrical activity other than the direct neuronal response to a given stimulus. Because the fly preparation, when properly done, is very stable, the observed noise (beyond the natural variably of the responses) most often results from ground-loops in the recording equipment, or is picked up from nearby electrical devices. Such noise is typically 50/60 Hz mains hum and its harmonics; but sometimes composed of more complex waveforms. To work out the origin of the noise, remove the fly preparation holder from the set-up, connect the recording and reference electrodes through a drop of fly Ringer (or place them in a small Ringer’s solution bath; see step 1.2.6) and record the signal in CC- or bridge-mode. If noise is observable on the recorded signal, this likely means that the noise is external to the fly preparation.

Another good test for identifying the origin of noise is to replace the electrode-holders with an electric cell model connected to the amplifier. In an ideally configured and grounded set-up, the recorded signal should now be practically noise-free, showing only stochastic bit-noise from the AD-converter (in the best case not even that!). If noise is still present, then recheck that all rig equipment is properly grounded. A convenient approach to detect ground-loops is to: (i) disconnect all the grounding wires from all the parts within the rig; (ii) ensure that, after doing this, every single part is actually isolated from ground, by means of an ohm-meter; (iii) connect the parts, one by one, to the central ground directly, not through any other part of the rig. Try also changing the equipment configurations. For example, sometimes moving the computer and monitor further away from the rig can reduce noise; yet at other times, moving the computer inside the equipment rack reduces noise. It is also worth unplugging nearby equipment to see if noise is reduced, or shield additional components. Furthermore, try unplugging or replacing different components of the recording equipment, especially BNC cables (which can have faulty ground connections). If only bit-noise is observed when using the cell model, the initial noise source is either the electrodes or the fly preparation itself. For example, it could be that the reference electrode is inadvertently touching a motor nerve or active muscle fibers inside the head capsule (or disturbing flight muscles in the thorax – if placed there). It is usually simplest to prepare a new fly for recording, taking care to minimize damage to the fly. But if the noise persists and is broadband, it is likely that the electrodes are suboptimal for the experiments; too sharp/fine (hence too noisy) or just wrong for the purpose; we have even seen quartz-electrodes acting as antennas – picking up faint broadcasting signals! Although iteration of the puller-instrument parameter settings to generate the just right microelectrodes for consistent high-quality recordings from specific cell-types can take a lot of effort, it is worth it. Once the recording electrodes are well-tailored for the experiments, they can provide long-lasting recordings of outstanding quality.

Sharp microelectrode recording techniques can be similarly applied to study neural information processing in multitude of preparations, including different processing layers in the insect eyes and brain^43,44. Because the microelectrode tips can be made very fine, these typically damage the studied cells less than most patch-clamp applications. Importantly, the modern sample-and-hold microelectrode amplifiers enable good control of the tips’ electrical properties^40,45-47. Thus, when correctly applied, this technique can provide reliable data from both in vivo^3,5,7-10,44 or in vitro⁴⁸ preparations with high signal-to-noise ratio at sub-millisecond resolution. Such precision would be impossible with today’s optical imaging techniques, which are noisier and slower. Moreover, the method can be used to characterize small cells’ electrical membrane properties both in current- and voltage-clamp configurations^{5,29,33,36,40-42,49}, providing valuable data for biophysical and empirical modeling approaches^{7,8,11,33,49-54} that link experiments to theory.

Materials

Stereo Zoom Microscope for making the fly preparation	Olympus	SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN30x-H/22	Capable of ~150X magnification with long working distance; bespoke heavy steel table mount stand
Stereomicroscope in the intracellular set-up	·  Olympus	Olympus SZX7; eyepieces: WHN30x-H/22	30x eyepieces are needed for seeing the electrode tip reflections well when driving it through the small corneal hole into the eye
	·  Nikon	Nikon SMZ645; eyepieces: C-W30x/7
Anti-vibration Table	·  Melles Griot	With metric M6 holes on the breadboard	Our bespoke rigs have a large hole drilled through the thick breadboard that lets in the fly preparation platform pole (houses a copper heatsink with electronics) from below
	·  Newport
Micromanipulators	·  Narishige	·  Narishige NMN-21	In our intracellular set-ups, different micromanipulator systems are used for driving the shap recording electrodes into the fly eye. All the listed manipulators are succesfully providing long-lasting stable recordings from Drosophila photoreceptors and LMCs.
	·  Huxley Bertram	·  Huxley xyz-axis with fine manual control
	·  Sensapex	·  Sensapex triple axis
	·  Märzhäuser	·  Märzhäuser DC-3K with additional x-axis piezo stepper and MS 314 controller
Magnetic Stands	Any magnetic base with on/off switch will do		For example, to manage cables inside the Faraday cage
Electrode Holders	Harvard Apparatus	ESP/W-F10N
Silver Wire	World Precision Instruments	AGW1510	0.3-0.5 mm diameter; needs to be chloridized for the electrode holders
Fiber Optic Light Source	Many different, including Olympus
Fiber Optic Bundles	·  UltraFine Technology		To deliver the LED light stimulus to the Cardan arm system. We use both liquid and quartz light guides (range from UV to IR)
	·  Thorn Labs
Fly Cathing Tube		P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Pack of 100 Pcs	Cut the conical bottom off from 50 ml Plastic Centrifuge Tube and glue a 1 ml pipette tip on it.
Digital Acquisition System	National Instruments
Single-electrode current/voltage-clamp microelectrode amplifier	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html	Outstanding performer!
Head-stage	Standard (+/- 150 nA)	For npi SEC-10LX
LED light sources and drivers	·  2-channel OptoLED (Cairn Research Ltd., UK)		Many of our stimulus systems are in-house built
	·  Self-designed and constructed
Acquisition and Analyses Software	Many companies to choose from		Biosyst; custom written Matlab-based system for experimental and theoretical work in the Juusola laboratory
Personal Computer or Mac			Ensure that PC or Mac is compatible with data acquisition system and software
Cardan arm system	Self-designed and constructed		Providing accurate x,y,z-positioning of the light stimuli
Peltier temperature control system	Self-designed and constructed
Faraday Cage	Self-constructed		Electromagnetic noise shielding
Filamented Borosilicate Glass Capillaries		Outer diameter: 1 mm
		Inner diameter: 0.5-0.7 mm
Filamented Quartz Glass Capillaries		Outer diameter: 1 mm
		Inner diameter: 0.5-0.7 mm
Pipette Puller	Sutter Instrument Company	Model P-2000 laser Flaming/Brown Micropipette Puller	For borosilicate reference electrodes, use the preset program #11 (patch electrodes): Heat = 350; Filament = 4; Velocity 36; Delay = 200).1.2.1). For borosilicate recording electrodes, use the preset program #12 (this typically pulls good conventional sharps  for photoreceptor recordings): Heat = 355; Filament = 4; Velocity 50; Delay = 225; Pull = 150. For LMC recordings, which require electrodes with finer tips, these values need to be adjusted. For pulling quartz capillaries, P-2000 manual suggests programs for fine tipped microelectrodes. These programs’ preset parameters serve as useful starting points for systematic modifications to generate electrodes with good penetration success and low recording noise.
Extracellular Ringer Solution for the reference electrode	Chemicals from Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sucrose	See the recipe in the protocol section
3 M KCl solution for filling the filamented recording microelectrode	Salts from Fisher Scientific	10010310, KCl
Petroleum jelly	Vaselin
Non-stainless steel razor blades
Blade holder/breaker	Fine Science Tools By Dumont	10053-09	9 cm
Blu-tack	Bostik		Alternatively, use molding clay
Forceps	Fine Science Tools By Dumont	11252-00	#5SF (super-fine tips)