कॉर्टेक्स टुकड़े का पता लगाने के बैक्टीरियल बीजाणु अंकुरण के दौरान
Summary
Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.
Abstract
The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.
Introduction
Endospores पाचन बैक्टीरिया है कि बैक्टीरिया प्रतिकूल वातावरण में जारी रहती है करने की अनुमति के निष्क्रिय रूप हैं। कई बीजाणु के गठन बैक्टीरिया में, बीजाणु गठन पोषक तत्व के अभाव से प्रेरित है, लेकिन इस प्रक्रिया में ऑक्सीजन या अन्य तनाव 1 पीएच, जोखिम में परिवर्तन के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। उनकी पाचन निष्क्रिय बीजाणु रूप में रहते हुए, बैक्टीरिया पराबैंगनी विकिरण, सुखाना, उच्च तापमान, ठंड और 2 का विरोध। Sporulation प्रक्रिया पर ज्ञान के अधिकांश मॉडल जीव में अध्ययन, बेसिलस subtilis से आता है। Sporulation प्रक्रिया डीएनए प्रतिकृति और एक अक्षीय रेशा 3,4 के गठन के साथ शुरू होता है। एक विषम पट फिर दो असमान आकार डिब्बों में सेल बिताते हैं। बड़े डिब्बे, मां सेल, छोटे डिब्बे, forespore समाई है। दोनों मां सेल और forespore जीन अभिव्यक्ति का समन्वय बीजाणु और मां सेल अंततः lyses परिपक्व करने के लिए, Dorman रिहाआसपास के वातावरण में 1 टी बीजाणु।
बीजाणु संरचना और संरचना में कई प्रजातियों के जीवाणु भर में संरक्षित है। बीजाणु कोर वनस्पति सेल की तुलना में कम पानी की सामग्री है और dipicolinic एसिड (डीपीए) 1,2 के साथ समृद्ध है। बीजाणु गठन के दौरान समाचार एजेंसी डीपीए के पानी के बदले में बीजाणु कोर में पंप है। कोर आसपास के एक भीतरी बीजाणु झिल्ली जहां, सबसे बीजाणु के गठन के बैक्टीरिया में, रिसेप्टर्स जो छोटे अणुओं है कि को प्रोत्साहित अंकुरण (germinants) को पहचान 2 स्थित हैं। सिर्फ बीजाणु के भीतर की झिल्ली के बाहर स्थित सेल दीवार पेप्टीडॉग्लीकैन की एक परत है। एक विशेष पेप्टीडॉग्लीकैन परत (कोर्टेक्स) कोशिका दीवार पेप्टीडोग्लायकन चारों ओर से घेरे और कोशिका दीवार पेप्टीडोग्लायकन [बारी एन एसिटाइलग्लूकोसेमाइन (एनएजी) और एन acetylmuramic एसिड (एनएएम)] के रूप में ही घटकों के कई से बना है। हालांकि, कॉर्टेक्स में गुटनिरपेक्ष आंदोलन के अवशेष का लगभग 50% muramic-δ लस्टम 5,6 करने के लिए परिवर्तित कर दिया गया है </s> अप। बीजाणु अंकुरण के दौरान, इन muramic-δ लस्टम अवशेष, बीजाणु कोर्टेक्स अपघट्य एंजाइमों (SCLEs) द्वारा मान्यता प्राप्त इस प्रकार की अनुमति कोर्टेक्स अपमानित किया जा करने के लिए (एक प्रक्रिया अंकुरण को पूरा करने के लिए आवश्यक है), लेकिन नहीं कोशिका दीवार रहे हैं। कोर्टेक्स आसपास के एक बाहरी झिल्ली और कोट प्रोटीन 2 की कई परतों है।
अंकुरण की प्रक्रिया को नियंत्रित बीजाणु के गठन बैक्टीरिया के लिए महत्वपूर्ण है। अंकुरण शुरू की है जब germinant रिसेप्टर्स उनके संबंधित germinants 2 के साथ बातचीत। कई बीजाणु के गठन बैक्टीरिया में, इन germinants अमीनो एसिड, शर्करा, न्यूक्लियोटाइड, आयनों या 2 उसके संयोजन कर रहे हैं सी। बेलगाम बीजाणु अंकुरण कुछ पित्त अम्ल, [जैसे, पित्त अम्ल (टीए)] और अमीनो एसिड (जैसे, ग्लाइसिन) 7-10 के संयोजन द्वारा शुरू की है। हालांकि वहाँ सेल्सियस के बीच मतभेद रहे हैं बेलगाम अंकुरण मार्ग और रास्ते में अध्ययन अन्य बीजाणु गठनऐसे बी के रूप में बैक्टीरिया, subtilis, सभी के लिए आम बीजाणु कोर्टेक्स नीचा करने के लिए एक वनस्पति सेल अंकुरित बीजाणु 2,8 से विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए परम आवश्यकता है। कॉर्टेक्स गिरावट (के रूप में कई clostridia में पाया जाता है) या SleC (के रूप में बी subtilis में पाया) SCLEs CwlJ / SleB द्वारा पूरा किया जा सकता है। कॉर्टेक्स हाइड्रोलिसिस सेल की दीवार और बीजाणु पर बाधा कम कर देता है। यह पूर्ण कोर पुनर्जलीकरण, सेलुलर चयापचय 2 के लिए आवश्यक प्रोटीन की कई reactivating में एक आवश्यक कदम के लिए अनुमति देता है।
जब बीजाणुओं उगना, एक चरण अंधेरे राज्य है और इस प्रक्रिया के लिए एक चरण उज्ज्वल राज्य से निष्क्रिय बीजाणु परिवर्तन 600 पर ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) में एक परिवर्तन से मापा जा सकता है एनएम 11। पिछले एक रिपोर्ट से पता चलता है आयुध डिपो में इस बदलाव के बारे में ज्यादा बीजाणु 12 से डीपीए की रिहाई के लिए कारण है कि। हमारे हाल के एक अध्ययन के दौरान, हम सी के समय की तुलना करने की मांग बेलगाम बीजाणु अंकुरण और निगरानीसमाचार एजेंसी डीपीए और कोर्टेक्स टुकड़े 9 की रिहाई। इस अध्ययन के लिए यह कोर्टेक्स टुकड़े की रिहाई पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण था, क्योंकि वे बीजाणुओं germinating द्वारा जारी किया जाने लगा।
वर्णमिति यहां इस्तेमाल किया परख कम करने के साथ समाप्त होता है शर्करा का पता लगाने के लिए एक विधि पर आधारित था Ghuysen एट अल। 13 विकसित की है। क्योंकि दूसरों शर्करा को कम करने 14 का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है या उन प्रोटोकॉल 15 को संशोधित किया है, इस विषय पर साहित्य भ्रमित किया जा सकता है। इधर, विस्तार शर्करा को कम करने के वर्णमिति पता लगाने सी germinating से मुक्ति के लिए एक कदम-दर-कदम विधि हम बेलगाम बीजाणुओं। हालांकि इस अध्ययन सी का उपयोग करता है बेलगाम बीजाणुओं को कम करने, शर्करा अन्य बीजाणु के गठन बैक्टीरिया से बीजाणुओं के अंकुरण के दौरान जारी इस प्रोटोकॉल 9,16,17 साथ पता लगाया जा करने में सक्षम हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
उत्तेजना पर, अंकुरण की प्रक्रिया के दौर से गुजर बीजाणुओं macromolecular संश्लेषण के लिए आवश्यकता के बिना उनके प्रतिरोध गुण खो देते हैं। जब बीजाणु अंकुरण शुरू हो रहा है, बीजाणु कोर पानी 2 के लिए विदेशी मुद्रा …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
परियोजना वर्णित एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान से पुरस्कार संख्या 5R01AI116895 द्वारा समर्थित है। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोगों या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।
Materials
| 2.0 mL screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p200 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p20 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| 100-1250uL pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1-200uL pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid – 10N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine | |||
References
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