Upptäcka Cortex Fragment Under Bacterial sporgroning
Summary
Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.
Abstract
The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.
Introduction
Endosporer är metaboliskt vilande former av bakterier som gör att bakterier att kvarstå i ogynnsamma miljöer. I många sporbildande bakterier, är sporbildning inducerad av näringsämnen deprivation men denna process kan regleras genom ändringar i pH, exponering för syre eller andra påkänningar 1. Även i deras metaboliskt vilande sporformen, bakterier motstå UV-strålning, uttorkning, högre temperaturer och frysa 2. De flesta av kunskap på sporulering processen kommer från studier i modellorganism, Bacillus subtilis. Sporuleringen Processen börjar med DNA-replikation och bildning av en axiell glödtråd 3,4. En asymmetrisk septum delar sedan cellen i två ojämnt dimensionerade fack. Den större fack, modercellen, omger den mindre fack, den forespore. Både modercellen och forespore samordna genuttryck att mogna sporen och modercellen till slut lyserar, släppa Dormant spor i den omgivande miljön en.
Spor struktur och sammansättning är konserverad i många bakteriearter. Sporkärnan har en lägre vattenhalt än den vegetativa cellen och är rikt med dipikolinsyra (DPA) 1,2. Under sporbildning är DPA pumpas in sporkärnan i utbyte mot vatten. Som omger kärnan är ett inre spor membranet där, i de flesta sporbildande bakterier är de receptorer som känner igen de små molekyler som stimulerar grobarhet (groddarna) beläget 2. Beläget strax utanför spor inre membran är ett skikt av cellväggs peptidoglykan. En specialiserad peptidoglykan skikt (cortex) omger cellväggen peptidoglykan och består av många av samma komponenter som cellväggs peptidoglykan [alternerande N-acetylglukosamin (NAG) och N-acetylmuramidsyra (NAM)]. Emellertid har cirka 50% av NAM rester i hjärnbarken omvandlats till muramic-δ-laktam 5,6 </supp>. Under sporgroning är dessa muramic-δ-laktam-rester som känns igen av de spor cortex lytiska enzymer (SCLEs), vilket gör det möjligt cortex som skall brytas ned (en process nödvändigt att komplettera groning) men inte cellväggen. Runt cortex är ett yttre membran och flera lager av höljeproteiner 2.
Styrning av processen på grobarhet är av avgörande betydelse för sporbildande bakterier. Groning initieras när groende receptorer interagerar med sina respektive groddar 2. I många sporbildande bakterier, dessa groddarna är aminosyror, sockerarter, nukleotider, joner eller kombinationer därav två. C. difficile sporgroning initieras genom kombinationer av vissa gallsyror, [t.ex., taurocholsyra (TA)] och aminosyror (t.ex. glycin) 7-10. Även om det finns skillnader mellan C. difficile groning vägen och vägarna studeras i andra sporbildandebakterier, såsom B. subtilis, är gemensam för alla absolut krav att försämra spor cortex för att möjliggöra ett vegetativt cell att växa från grodda sporer 2,8. Cortex nedbrytning kan åstadkommas genom den SCLEs CwlJ / SleB (som finns i B. subtilis) eller SLEC (som återfinns i många Clostridia). Cortex hydrolys minskar begränsningen på cellväggen och spor. Detta möjliggör full kärn rehydrering, ett nödvändigt steg i reaktive många av de proteiner som behövs för cellulär metabolism 2.
När sporerna gror, kan de vilande spor ändras från en fas-ljus tillstånd till en fas-mörkt tillstånd och denna process mätas genom en förändring i optisk densitet (OD) vid 600 nm 11. En tidigare rapport tyder på att en stor del av denna förändring i OD beror på frisättning av DPA från spor 12. Under våra senaste studie, försökte vi att jämföra tidpunkten för C. difficile sporgroning och övervakadefrisättning av DPA och cortex fragment 9. För denna studie var viktigt att övervaka frisättningen av cortex fragment när de började att släppas genom groende sporer.
Den kolorimetriska analysen som används här baserades på en metod för att detektera sockerarter med reducerande ändarna utvecklade Ghuysen et al. 13. Eftersom andra har beskrivit protokoll för detektion av reducerande sockerarter 14 eller har ändrat dessa protokoll 15, kan litteraturen om detta ämne vara förvirrande. Här har vi detaljerat en steg-för-steg-metod för kolorimetrisk detektion av reducerande sockerarter som frigöres från groende C. difficile sporer. Även denna studie använder C. difficile sporer, reducerande socker släpptes under groning av sporer från andra sporbildande bakterier kan detekteras med detta protokoll 9,16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vid stimulering, sporer som genomgår processen för groning förlorar sina hållfasthetsegenskaper utan behov av makromolekylära syntes. När sporgroning utlöses släpper sporkärnan DPA i utbyte mot vatten 2. Grund av den höga DPA innehållet i vilande spor är sporkärnan under intensiv osmotiska trycket och den specialiserade peptidoglykan, cortex, hjälper till att förhindra kärnan från att svälla genom att agera, förmodligen, som en barriär mot expansions 2.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet beskrivs stöds av Award nummer 5R01AI116895 från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute of Allergy och infektionssjukdomar eller National Institutes of Health.
Materials
| 2.0 mL screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p200 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p20 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| 100-1250uL pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1-200uL pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid – 10N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine | |||
References
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
- Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
- Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
- Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
- Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
- Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
- Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
- Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
- Ghuysen, J. -. M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
- Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
- Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
- Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
- Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
- Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
- Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
- Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
- Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
- Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
- Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
- Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
- Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
- Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
- Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
