Mucin Agarose ג'ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי
Summary
Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.
Abstract
מוקיוס, החלבונים הריריים משטחים ריריים-glycosylated בכבדות, התפתחו כמרכיב מרכזי של הגנה מולדת ידי גינה האפיתל נגד פתוגנים פולשים. תפקידה המרכזי של מולקולות אלו הוא להקל השמנת חלקיקים ופינוי תוך קידום שימון של הרירית. במהלך סינתזת החלבון, מוקיוס לעבור O-glycosylation ו multimerization אינטנסיבי, אשר להגדיל באופן משמעותי את מסת וגודל המולקולות האלה. שלאחר translational שינויים אלה הם קריטיים עבור מאפייני viscoelastic של ריר. כתוצאת האופי ביוכימיות biophysical המורכבת של מולקולות אלה, עובדים עם מוקיוס מספק אתגרים רבים כי לא ניתן להתגבר על ידי שיטות ניתוח חלבון קונבנציונליות. למשל, גבוה בעל המשקל המולקולרי שלהם מונע גירת electrophoretic באמצעות ג'ל polyacrylamide הקבוע והטבע הדביק שלהם גורם הידבקות צינורות הניסיונות. עם זאת, חוקרים את התפקיד של מוקיוס בבריאות(למשל., שמירה על שלמות רירית) ומחלות (למשל., Hyperconcentration, mucostasis, הסרטן) צבר לאחרונה עניין מוקיוס נחקרים כיעד טיפולי. הבנה טובה יותר של הייצור והתפקוד של מקרומולקולות mucin עלולה להוביל לגישות פרמקולוגיות רומן, למשל, מעכבי exocytosis גרגיר mucin ו / או סוכני mucolytic. לכן, פרוטוקולים עקבי ואמין לחקור ביולוגיה mucin הן קריטיות בהתקדמות המדע. כאן אנו מתארים שיטות קונבנציונליות להפריד מקרומולקולות mucin ידי אלקטרופורזה באמצעות ג'ל agarose, להעביר החלבון לתוך קרום nitrocellulose, וכדי לזהות אותות עם נוגדנים ספציפיים mucin וכן הקורא ג'ל ניאון אינפרא אדום. טכניקות אלה חלות נרחבים כדי לקבוע quantitation mucin, multimerization וכדי לבדוק את ההשפעות של תרכובות תרופתיות על מוקיוס.
Introduction
מוקיוס מיוצר בדרך כלל על ידי משטחים ריריים המרפדים חללים חשופים לסביבה החיצונית (למשל., נשימה, עיכול, קטעי רבייה, משטח עין), כמו גם איברים פנימיים (למשל, לבלב, כיס מרה, בלוטות חלב). הנוכחות של גליקופרוטאינים אלה שומר הידרציה שטח מהווה מכשול פיזי מפני פתוגנים. למרות הייצור mucin חיוני הרירית בריאות, mucin hyperconcentration ו / או נכסים ריר סוטה יכול להוביל הפרעות בצינור, קולוניזציה חיידקית ודלקת כרונית, אשר יכול לגרום נזק לרקמות בלתי הפיך. מפל דומה של אירועים הם נצפו במחלות כמה, למשל., סיסטיק פיברוזיס 1, דלקת אוזן תיכונה כרונית 2 ו הצרויקו זיהום 3. לכן, חשוב להבין את התפקיד של מוקיוס בבריאות ובחולי ולהקים פרוטוקולים שיגרתי לזיהוי חלבונים.
עד כה19 גני מוקיוס, זוהו לקודד עבור רשתות פוליפפטיד גדולות החל מ- 1,200 (למשל., MUC1) 22,000 (למשל, MUC16) חומצות אמינו. משפחת גנים mucin ניתן לחלק לשתי תת: את מוקיוס קרום הקשורים, מעורב מיגון איתות פני התא, ואת מוקיוס יוצרי ג'ל, אחראי המאפיינים viscoelastic של ג'לים ריר. מוקיוס קרום הקשורים ברובם monomeric ולצרף אל משטחי תא באמצעות תחום קרום פורש הידרופובי. לעומת זאת, מוקיוס יוצרי ג'ל להחזיק מספר גורם פון Willebrand (vWF)-כמו ציסטאין עשיר תחומים חיוניים להיווצרות רשתות פולימריות דינמית. גליקנים גדולים המחוברים סרין ושאריות תראונין מופצים ברחבי apomucin. אוליגוסכרידים O צמודים הצפופים אלה יכולים לתרום עד 80% של המשקל המולקולרי 4. תוך אג"ח דיסולפיד הבין-מולקולרי חיבור מונומרים mucin להבטיח את תקינותו של רשתות ג'ל mucink. כתוצאה glycosylation ו multimerization כבד, מוקיוס הם בין המולקולות הגדולות בעולם החי ולא יכול להיות מנותח על ידי ג'ל אלקטרופורזה רגיל באמצעות ג'ל polyacrylamide SDS-PAGE קונבנציונאלי וסולמות חלבון סטנדרטי. שיטות אלה נפתרות / חלבונים נפרדים עם משקל מולקולרי נמוך מ -250 kDa בעוד מונומרים mucin יכולים להגיע עד 2 מד"א במקרה של MUC16. עם זאת, סולמות חלבון גבוה משקל מולקולרי יכולים לשמש כדי לחקור מונומרים mucin קטנים (כלומר., MUC1).
מגוון של טכניקות ניתן ליישם ללמוד גודל mucin, קונפורמציה ואינטראקציה. באופן מסורתי, אפיון ביוכימי של מוקיוס מושגת על ידי mucin בידוד באמצעות צנטריפוגה צפיפות שיפוע isopycnic חיץ denaturing, ואחריו כרומטוגרפיה בגודל הדרה ו immunodetection (למשל., סופג חריץ) 5. דינמי ו / או פיזור אור רב-זווית לספק מידע על מצב oligomeric של דגימות mucin עשירי <sup> 1. בנוסף, צנטריפוגה אזורי-שיעור בשילוב עם immunodetection מיקרוסקופית אלקטרונים חודרת משמשים בדרך כלל כדי לקבוע את הקונפורמציה macromolecular של מוקיוס 6. ספקטרומטריית מסה משמשת גם לכמת מוקיוס, לזהות מחשוף פרוטאוליטים ולנתח 1,7,8 רכב oligosaccharide. שיטות אלו הן יקרות, זמן רב ולעתים קרובות דורשים כמויות גדולות ו / או ריכוזים גבוהים של מדגם. המתודולוגיה המתוארת במסמך זה, כלומר., Mucin הפרדה על ידי אלקטרופורזה, ניתנת לשחזור, בעלות נמוכה והוא יכול לשמש במחקרי תפוקה גבוהה כדי לספק quantitation mucin ביחס ולחקור הרכבת פולימרים. עם זאת, assay זה דורש נוגדנים גבוהה זיקה גבוהה סגולי mucin כי לא יהיו זמין עבור מוקיוס נדיר (למשל., MUC19) או מינים מסוימים (לדוגמא., חזיר, חמוס).
המערבי סופג Agarose מתאים לפתרון מגוון רחב של דוגמאות עשיר mucin עם Concentraהמשא הנעים בין 50 מיקרוגרם / מ"ל (למשל., שטיפות התא) עד 5 מ"ג / מ"ל (למשל., ליחה). Assay זה הוצג בשנת 1990 בוצע רק כמה מעבדות מיוחדות 9,10. בתחילה, טכניקה זו סייעה לזהות תת-אוכלוסיות של מונומרים mucin בהפרשות אדם הנשימה 11,12 ואישר את תהליך oligomerization בתאים הגביע, אשר מורכב של היווצרות dimer ב reticulum endoplasmic ואחריו דימר multimerization במנגנון Golgi 13. לאחרונה, הדור של נוגדנים polyclonal נגד מוקיוס murine הקל מחקרים על במודלים של בעלי חיים קטנים (למשל., Mucin לקוי, βENaC, במודלים של עכברים OVA מאותגרי) ופתח תחום חדש של מחקר מחקרים פרה תרכובות תרופתי בדיקות שמטרתן הסרת ריר מ הריאות 14-17. כתוצאה עניין גובר mucin ביולוגיה הדור של הרומן, נוגדנים mucin ספציפי יותר, אנו מתארים herein המתודולוגיה להפריד מוקיוס ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose, ואקום העברת nitrocellulose וזיהוי פלורסנט אינפרא אדום בשני צבעים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול של mucin מערבי סופג מתוארת וידאו זה משלב טכניקות קונבנציונליות המשמשות ביולוגיה מולקולרית להפריד ולהעביר מקרומולקולות גדולות, כגון דנ"א, עם טכניקות קבועות לגילוי חלבון, כלומר., Immunoblotting. באותה הטכניקה יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את הביולוגיה של glycosamin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.
Materials
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50g |
| 20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500mL |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200ug |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100ug |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from ‘normal’ human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
