Mucine Agarose Gel Electrophoresis: Western Blot pour les glycoprotéines de haut poids moléculaire,
Summary
Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.
Abstract
Mucines, les protéines fortement glycosylées qui tapissent la surface des muqueuses, ont évolué comme un élément clé de la défense innée en protégeant l'épithélium contre les agents pathogènes envahisseurs. Le rôle principal de ces macromolécules est de faciliter le piégeage des particules et de dégagement, tout en favorisant la lubrification de la muqueuse. Au cours de la synthèse des protéines subissent une intense mucines O-glycosylation et multimérisation, ce qui augmente considérablement la masse et la taille de ces molécules. Ces modifications post-traductionnelles sont critiques pour les propriétés viscoélastiques du mucus. En raison de la nature biochimique et biophysique complexe de ces molécules, en travaillant avec des mucines fournit de nombreux problèmes qui ne peuvent pas être résolus par des méthodes d'analyse des protéines classiques. Par exemple, leur haut poids moléculaire empêche la migration électrophorétique par des gels de Polyacrylamide réguliers et leur nature collante provoque l'adhérence à un tube expérimental. Cependant, étudier le rôle des mucines dans la santé(Par exemple., Le maintien de l' intégrité des muqueuses) et de la maladie (par exemple., Hyperconcentration, mucostase, cancer) a récemment suscité un intérêt et mucines sont à l'étude comme cible thérapeutique. Une meilleure compréhension de la production et la fonction des macromolécules mucine peut conduire à de nouvelles approches pharmaceutiques, par exemple, les inhibiteurs de la mucine exocytose de granules et / ou agents mucolytiques. Par conséquent, des protocoles cohérents et fiables pour étudier la biologie mucine sont essentiels pour le progrès scientifique. Ici, nous décrivons des méthodes classiques pour séparer les macromolécules de mucine par électrophorèse en utilisant un gel d'agarose, transfert des protéines dans une membrane de nitrocellulose, et à détecter le signal avec des anticorps spécifiques de la mucine, ainsi que l'infrarouge lecteur de gel de fluorescence. Ces techniques sont largement applicables pour déterminer la mucine quantification, multimérisation et de tester les effets des composés pharmacologiques sur mucines.
Introduction
Les mucines sont normalement produites par des surfaces muqueuses qui tapissent les cavités exposées à l'environnement extérieur (par exemple., Respiratoires, digestifs, les secteurs de la reproduction, la surface oculaire), ainsi que les organes internes (par exemple, le pancréas, la vésicule biliaire, les glandes mammaires). La présence de ces glycoprotéines maintient l'hydratation de la surface et forme une barrière physique contre les agents pathogènes. Bien que la production de mucine est essentielle à la santé des muqueuses, mucine hyperconcentration et / ou des propriétés de mucus aberrantes peut conduire à obstruction du canal, la colonisation bactérienne et l'inflammation chronique, qui peut causer des lésions irréversibles des tissus. Une cascade d'événements semblables sont observés dans plusieurs maladies, par exemple., La fibrose kystique 1, otite moyenne chronique 2 et l' infection cervico 3. Par conséquent, il est important de comprendre le rôle des mucines dans la santé et la maladie, et d'établir des protocoles de routine pour l'identification des protéines.
À ce jour, 19 mucines gènes ont été identifiés et codent pour de grandes chaînes de polypeptides allant de 1200 (par exemple., MUC1) à 22.000 (par exemple, MUC16) acides aminés. La famille des gènes de mucine peut être divisé en deux sous-types: les mucines associées à la membrane, impliqué dans la signalisation cellulaire et la surface de blindage, et les mucines formant un gel, responsable des propriétés viscoélastiques du gel de mucus. mucines associées à la membrane sont essentiellement monomère et se fixent sur les surfaces cellulaires par l'intermédiaire d'un domaine transmembranaire hydrophobe. En revanche, les mucines formant des gels possèdent plusieurs facteur Willebrand (FvW) -comme et riches en cysteine des domaines qui sont essentiels pour la formation de réseaux polymères dynamiques. Grandes glycanes sont attachés à la sérine et thréonine répartis dans la apomucine. Ces oligosaccharides O-liés denses peuvent contribuer jusqu'à 80% du poids moléculaire 4. Intra- et inter-moléculaires des liaisons disulfure reliant les monomères mucine assurent l'intégrité du networ de gel de mucinek. À la suite de glycosylation lourd et multimérisation, mucines sont parmi les plus grandes molécules dans le monde animal et ne peuvent pas être analysés par électrophorèse sur gel standard en utilisant un gel SDS-PAGE polyacrylamide classique et échelles de protéines standard. Ces méthodes résolvent / protéines séparées avec des poids moléculaires inférieurs à 250 kDa tandis que les monomères mucine peuvent atteindre jusqu'à 2 MDa dans le cas de MUC16. Cependant, à haute masse moléculaire échelles de protéines peuvent être utilisées pour étudier les petits monomères mucine (ie., MUC1).
Diverses techniques peuvent être appliquées pour étudier la taille de la mucine, la conformation et de l'interaction. Traditionnellement, la caractérisation biochimique des mucines est réalisée par isolement mucine par l' intermédiaire isopycnique en gradient de densité centrifugation dans un tampon dénaturant, suivie d' une Chromatographie d'exclusion de taille et immunodétection (par ex., Un slot blot) 5. Dynamique et / ou la diffusion de lumière multi-angle fournir des informations sur l'état oligomérique d'échantillons de mucine riche <sup> 1. En outre, les taux zonal centrifugation couplé à l' immunodétection et la microscopie électronique à transmission sont communément utilisés pour déterminer la conformation macromoléculaire de mucines 6. La spectrométrie de masse est également utilisée pour quantifier les mucines, détecter le clivage protéolytique et d' analyser la composition oligosaccharide 1,7,8. De telles techniques sont coûteuses, prennent du temps et exigent souvent de grands volumes et / ou des concentrations élevées d'échantillon. La méthodologie décrite ici, à savoir., Mucine séparation par électrophorèse, reproductible, peu coûteuse et peut être utilisée dans les études à haut débit pour fournir mucine par rapport quantification et d' étudier l' assemblage du polymère. Cependant, ce test nécessite de haute affinité, de haute spécificité des anticorps de mucine qui peuvent ne pas être disponibles pour les mucines rares (par exemple., MUC19) ou certaines espèces (par exemple., Porc, furet).
Agarose Western blot est adapté pour résoudre une grande variété d'échantillons de mucine riche avec concentrations allant de 50 pg / ml (par ex., des lavages cellulaires) à 5 mg / ml (par ex., du crachat). Cet essai a été introduit dans les années 1990 et n'a été réalisée dans quelques laboratoires spécialisés 9,10. Dans un premier temps , cette technique a permis d' identifier des sous – populations de monomères de mucine dans les sécrétions respiratoires humaines 11,12 et a confirmé le procédé d'oligomérisation dans des cellules caliciformes, qui comprend la formation du dimère dans le réticulum endoplasmique suivie dimère multimérisation dans l'appareil de Golgi 13. Plus récemment, la production d'anticorps polyclonaux contre mucines murins facilité des études sur des petits modèles animaux (par exemple., Mucine modèles de souris déficientes, βENaC, OVA contestées) et a ouvert un nouveau champ de recherche pour les études précliniques composés d'essais pharmacologiques visant à éliminer le mucus les poumons 14-17. En raison de l'intérêt croissant pour la mucine biologie et la génération de nouveaux anticorps de mucine plus spécifiques, nous décrivons herein la méthode pour séparer les mucines par électrophorèse sur gel d'agarose, transfert sous vide à la nitrocellulose et à deux couleurs de détection de fluorescence infrarouge.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole de mucine par Western Blot décrit dans cette vidéo combine les techniques classiques utilisées en biologie moléculaire pour séparer et transférer des macromolécules telles que l' ADN, par des techniques normales pour la détection des protéines, à savoir., Immunotransfert. La même technique peut être appliquée pour étudier la biologie des glycosaminoglycanes complexes, telles que la dégradation de l' acide hyaluronique de haut poids moléculaire 18. Bien que cette t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.
Materials
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50g |
| 20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500mL |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200ug |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100ug |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
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