Abstract
Mucinen, de zwaar-geglycosyleerde eiwitten voering mucosale oppervlakken, hebben zich ontwikkeld als een belangrijk onderdeel van de aangeboren verdediging door het epitheel te beschermen tegen binnendringende ziekteverwekkers. De belangrijkste rol van deze macromoleculen is deeltje trapping en de klaring te vergemakkelijken terwijl het bevorderen van de smering van het slijmvlies. Tijdens eiwitsynthese, mucinen ondergaan intense O-glycosylatie en multimerisatie, die de massa en omvang van deze moleculen sterk te verhogen. Deze post-translationele modificaties zijn cruciaal voor de visco-elastische eigenschappen van mucus. Als gevolg van de complexe biochemische en biofysische eigenschappen van deze moleculen, samen met mucinen biedt vele uitdagingen die niet kan worden overwonnen door conventionele eiwit analysemethoden. Bijvoorbeeld hun hoge molecuulgewicht voorkomt elektroforetische migratie via gewone polyacrylamidegels en hun kleverige aard veroorzaakt adhesie experimentele tubing. Echter, onderzoeken de rol van mucinen in gezondheid(Bijv., Handhaven mucosale integriteit) en ziekte (bv., Hyperconcentration, mucostasis, kanker) onlangs verworven belang en mucinen worden onderzocht als een therapeutisch doelwit. Een beter begrip van de productie en functie van macromoleculen mucine kan leiden tot nieuwe farmaceutische benaderingen, bijvoorbeeld remmers van mucine granule exocytose en / of mucolytische middelen. Daarom, consistente en betrouwbare protocollen te onderzoeken mucine biologie zijn van cruciaal belang voor wetenschappelijke vooruitgang. We beschrijven conventionele methoden mucine macromoleculen scheiden door elektroforese met gebruik van agarose gel, overbrengen eiwit in nitrocellulose membraan en gedetecteerd signaal met mucine-specifieke antilichamen en infrarood fluorescerende gel lezer. Deze technieken zijn breed toepasbaar te bepalen mucine kwantificering, multimerisatie en om de effecten van farmacologische verbindingen op mucinen testen.
Introduction
Mucines worden gewoonlijk geproduceerd door mucosale oppervlakken die holten blootgesteld aan de buitenomgeving lijn (bijv., Ademhaling, spijsvertering, voortplantingsstelsel, oogoppervlak) en inwendige organen (bijvoorbeeld, pancreas, galblaas, borstklieren). De aanwezigheid van deze glycoproteïnen onderhoudt oppervlak hydratatie en vormt een fysieke barrière tegen ziekteverwekkers. Hoewel mucine productie essentieel voor de gezondheid mucosale, mucine hyperconcentration en / of afwijkende slijm eigenschappen kunnen leiden tot obstructie duct, bacteriële kolonisatie en chronische ontsteking, onomkeerbare weefselschade kan veroorzaken. Een vergelijkbare cascade van gebeurtenissen worden waargenomen in een aantal ziekten, bv., Cystic fibrosis 1, chronische otitis media 2 en cervicovaginal infectie 3. Daarom is het belangrijk om de rol van mucinen bij gezondheid en ziekte begrijpen en routine protocollen vast te stellen voor proteïne-identificatie.
Daten, 19 mucinen genen geïdentificeerd en coderen voor grote polypeptideketens die variëren van 1200 (bijv., MUC1) tot 22.000 (bijvoorbeeld MUC16) aminozuren. Het mucine genfamilie kan worden onderverdeeld in twee subtypen: de membraan geassocieerde mucinen, betrokken bij cel-signalering en de afscherming, en de gelvormende mucinen, verantwoordelijk voor de visco-elastische eigenschappen van mucus gels. Membraan-geassocieerde mucinen zijn meestal monomere en hechten aan het celoppervlak via een hydrofoob membraan omspannende domein. Daarentegen gelvormende mucinen hebben verschillende von Willebrand factor (vWF) -achtige en cysteïnerijke domeinen die essentieel zijn voor de vorming van dynamische polymère netwerken. Grote glycanen zijn aan serine en threonine residu verdeeld over het apomucin. Deze dichte O-gekoppelde Oligosacchariden kunnen oplopen tot 80% van het molecuulgewicht 4. Intra- en intermoleculaire disulfidebindingen verbinden mucine monomeren de integriteit van de mucine gel network. Door zware glycosylering en multimerisatie, mucinen tot de grootste moleculen in het dierenrijk en kan niet worden geanalyseerd met standaard gelelektroforese met gebruikelijke SDS-PAGE polyacrylamide gel en standaard eiwit ladders. Deze werkwijzen lossen / de eiwitten met molecuulgewichten lager dan 250 kDa, terwijl mucine monomeren kan oplopen tot 2 MDa bij MUC16. Echter, hoog molecuulgewicht eiwit ladders worden gebruikt om kleine mucine monomeren bestuderen (bijv., MUC1).
Verschillende technieken kunnen worden toegepast op mucine grootte, bouw en interactie te bestuderen. Traditioneel wordt biochemische karakterisering van mucinen bereikt door mucine-isolatie via isopycnische dichtheid-gradiënt centrifugeren in denaturerende buffer, gevolgd door grootte-uitsluitingschromatografie en immunodetectie (bijv., Slot blotting) 5. Dynamisch en / of multi-angle lichtverstrooiing informatie verstrekken over de oligomere toestand van mucine-rijke monsters <sup> 1. Bovendien zijn snelheid-zonale centrifugatie gekoppeld immunodetectie en transmissie elektronenmicroscopie gebruikte macromoleculaire conformatie van mucinen 6 bepalen. Massaspectrometrie wordt ook gebruikt om mucinen kwantificeren detecteren proteolytische splitsing en analyseren oligosaccharide samenstelling 1,7,8. Dergelijke technieken zijn duur, tijdrovend en vereisen vaak grote hoeveelheden en / of hoge concentraties van het monster. De werkwijze hierin beschreven, bijv., Mucine scheiding door elektroforese reproduceerbaar, goedkoop en kan worden gebruikt in high-throughput studies om relatieve kwantificering mucine geven en te onderzoeken chemische polymeren. Echter, deze test vereist een hoge affiniteit, hoge specificiteit mucine antilichamen die niet beschikbaar zijn voor zeldzame mucinen kunnen zijn (bijv., MUC19) of bepaalde soorten (bijv., Varken, fret).
Agarose Western blotting geschikt om allerlei mucine-rijke monsters met concentraties oplossenties die variëren van 50 ug / ml (bijv., cellen wast) tot 5 mg / ml (bijv., sputum). Deze test werd geïntroduceerd in de jaren 1990 en werd alleen uitgevoerd in enkele gespecialiseerde laboratoria 9,10. Aanvankelijk deze techniek hielp identificeren subpopulaties van mucine in menselijke monomeren sputum 11,12 en bevestigde het oligomerisatie proces slijmbekercellen, bestaande uit dimeervorming in het endoplasmatisch reticulum, gevolgd door dimeer multimerisatiedomein in het Golgi-apparaat 13. Meer recent, het genereren van polyklonale antilichamen tegen muizen mucinen vergemakkelijkt studies op kleine diermodellen (bv., Mucine tekort, βENaC, OVA-uitgedaagd muismodellen) en opende een nieuw onderzoeksgebied voor preklinische studies testen van farmacologische verbindingen die gericht zijn op het verwijderen van slijm uit de longen 14-17. Als gevolg van een toenemende belangstelling mucine biologie en het genereren van nieuwe, meer specifieke mucine antilichamen beschrijven we herein de methodologie mucinen gescheiden door agarose gelelektroforese, vacuümoverdracht naar nitrocellulose en twee-kleuren infrarood fluorescentiedetectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid Buffers voor Mucine Gel Western Blotting
- Bereid 1 liter 50x TAE (Tris-acetaat-EDTA) buffer.
- In 700 ml gedestilleerd water (dH 2 O) voeg 242 g Tris-base (0,4 M), 57,1 g ijsazijn (gewicht vloeistof) (0,2 M) en 14,61 g ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (50 mM).
- De pH instellen op 8,0 en maken het volume tot 1 liter met dH 2 O.
- Bereid 10 ml van 10x laadbuffer.
- Bereid 5 ml 1 x TAE buffer. Hiervoor voeg 5 ml glycerol (50%), 25 mg broomfenolblauw (0,25%) en 100 mg natriumdodecylsulfaat (SDS) (1%).
- Bereid 2 liter 20x natrium zoutoplossing citraat (SSC) buffer.
- In 1,5 liter dH 2 O, voeg 350,6 g NaCl (3 M) en 176.4 g trinatriumcitraat (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0,3 M). Stel de pH tot 7,0 en vul aan tot 2 liter met dH 2 O.
- Bereid 1 liter 1x TAE-0,1% SDS buffer.
- Voeg 20 ml 50 x TAE tot 980 ml dH 2 O. Voeg 1 g SDS tot een 0,1% SDS-TAE oplossing te maken.
2. TAE-SDS Agarose Gel Voorbereiding
- (. Dat wil zeggen, 150 ml) - 7 mm dikke gel Giet voldoende volume 1x TAE-0,1% SDS buffer in een microwavable erlenmeyer aan een 5 te maken. Voeg 0,8% (1,2 g) agarose poeder.
- Magnetron kolf in 30 seconden met periodieke zwenken totdat agarose volledig is opgelost (gewoonlijk 1-3 min). Gebruik heet de hand pads tijdens dit proces. Wees voorzichtig met overkoken terwijl wervelende.
- Laat de agarose oplossing afkoelen 5-10 min. Opmerking: De agaroseoplossing klaar te gieten wanneer bodem van de fles kan worden overgelaten aan de handpalm 5 sec.
- Elektroforesegel casting tray (10 x 15 cm) door het afdichten van de randen met tape en het goed kammen in positie.
- Giet agarose oplossing langzaam in tHij casting lade om de vorming van luchtbellen te vermijden. Verwijder bellen met behulp van een pipet tip. Wacht tot de gel te koelen en volledig te stollen. Eenmaal verhard, verwijder de kam langzaam om te voorkomen dat het instorten van de putten door zuiging en verwijder de tape van de randen van de lade.
- Plaats agarosegel in de gel doos en de elektroforese-unit vullen met 1x TAE-0,1% SDS buffer totdat de gel volledig gedekt.
3. Sample laden en elektroforese Separation
Opmerking: In ons laboratorium hebben we vaak gebruikt monsters van zowel muis als mens, waaronder bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF; beide soorten), mobiele spoelvloeistof van humane bronchiale epitheelcellen (HBE), en speeksel en sputum stalen. Monsters kunnen worden gedenatureerd in 6 M ureum bij de inzameling of opgeslagen voor een korte periode van tijd (6 uur) door het toevoegen van protease-remmer cocktail.
- Bereiden monsters voor door toevoegen van 10% van lading kleurstof aan elk monster (bijv., 30 pl monster en 3pl kleurstof). Homogeniseren monsters door en neer te pipetteren. Kort spin down buizen bij 5000 rpm tot druppeltjes te verzamelen.
- Zorgvuldig belasting gelijk volume van monsters in de putjes.
- Pre-nat tips en / of gebruik maken van positieve verplaatsing pipetten om het laden van zeer viskeuze monsters te vergemakkelijken. Langzaam aspireren 80 - 90% van het monster-kleurstof-oplossing (dat wil zeggen, 27-30 pi) aan pipetteren luchtbellen te vermijden.
- langzaam geladen op de bodem van de putjes en geleidelijk de pipetpunt boven bewegen. Voor monsters die bevestigd blijven aan de pipetpunt, applicatie onder een hoek van 45 ° en langwerpig recht boven de put of het zachtjes gebruik van het goed aan de draderige slijm breken. Laat de putten niet overbelasten.
- Sluit de elektroden uit de gel in om de elektroforese stroomgenerator. Zorg ervoor dat de elektroden correct zijn aangesloten (bijv., Rode kabel aangesloten op de positieve uitgang van de generator) negatief staan ten laste mucinen te lopen in de richting van de positieve elektrode.
- Voer de elektroforese bij 80 Volt gedurende 90 min bij één kam gel of 60-75 min voor een dubbele kam gel om overlap tussen de twee rijen voorkomen.
- Schakel generator stroom uit en haal de elektroden uit het stopcontact.
- Verwijder voorzichtig de gel uit de gel doos met een hand aan weerszijden van het gietstuk te waarborgen lade de gel blijft zitten.
4. Verminder Agarose Gel voor Efficient Mucine Transfer
- Plaats de gel flat zorgvuldig in een glazen container. Spoel de gel met dH 2 O om sporen van TAE-SDS buffer te verwijderen.
- Bereid 1 liter 4x SSC buffer door het toevoegen van 200 ml van 20x SSC in 800 ml dH 2 O. Voeg 200 ml van 10 mM dithiothreïtol (DTT) 4x SSC door toevoeging van 309 mg van vers DTT in 200 ml 4x SSC buffer.
- Week de gel met DTT-4x SSC buffer en deksel. Schud gedurende 20 min (10 omwentelingen per minuut). Spoel gel met DTT-vrije 4x SSC buffer.
- Bereid vacuüm vloeipapier voor de overdracht.
- Knip nitrocellulose membraan afmetingen iets breder dan de gel (bijv., 10 x 15 cm).
- Natte poreuze mat met dH 2 O en plaats het gladde-side-up in het vloeipapier.
- Natte nitrocellulosemembraan met DTT-vrije 4x SSC buffer en plaats deze in het midden van de poreuze mat.
- Bedek de poreuze mat met een rubberen pakking, waardoor de opening van de pakking juist uitgelijnd met het nitrocellulosemembraan. Als poreuze mat is nog steeds zichtbaar, zorgvuldig aan te passen het membraan om ervoor te zorgen dat er geen opening tussen de pakking en membraan.
- Plaats de agarosegel voorzichtig bovenop het membraan. Verzekeren gel vormt een afdichting met de pakking en de putjes van de gel staan het membraan voor overdracht.
- Het vormen van bellen tussen de membraan en de gel. Om het te minimaliserenblaasvorming, spuiten enkele druppels 4x SSC buffer op het membraan en schuif de gel van boven naar beneden om eventuele luchtbellen gevormd spoelen. Beweeg de gel op het membraan eiwitten begint onmiddellijk blot.
- Zorgvuldig betrekking hebben op de gel met 4x SSC buffer.
- Begin mucine overdracht door zuiging.
- Zet vacuüm vloeipapier ON en zet druk bij 40 - 50 mbar. Voeg enkele druppels 4x SSC buffer op de gel elke 5-10 minuten om de gel uitdroogt. Run transfer voor 90 min. Optioneel: Na voltooiing, markeer de putten met een potlood voor oriëntatie.
- Gooi de gel en ophalen nitrocellulosemembraan kunststofleidingen pincet aan de rand van het membraan.
6. Membraan Blocking en Detection
- Spoel membraan onmiddellijk met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Laat je niet door het membraan uitdrogen.
- Dompel het membraan in 50 ml van 3% melk-PBS blokkerende buffer en leg ze op een rocker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Na incubatie, gooi de blokkerende buffer.
- Dompel membraan in 1% melk-PBS primaire antilichaam-oplossing. Incubeer het membraan in de primaire antilichaamoplossing gedurende de nacht op een rocker bij 4 ° C. Na incubatie, gooi het primaire antilichaam oplossing. Verdun het primaire antilichamen een 1: 2000 verhouding van antilichaam oplossing blokkerende buffer. Opmerking: Voor monsters afkomstig van muizen, maken we gebruik van UNC 222 konijnen anti-Muc5b en geit anti-Green Fluorescent Protein (GFP). Voor monsters die afkomstig zijn van mensen, maken we gebruik van H300 anti-MUC5B en 45M1 anti-MUC5AC primaire antilichamen.
- Was membraan 3 maal met PBS gedurende 10 minuten op een rocker.
- Dompel membraan in 1% melk-PBS secundair antilichaam-oplossing. Verdun de secundaire antilichamen die een 1: 7500 verhouding antilichaamoplossing het blokkeren buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een rocker (bijvoorbeeld 700 anti-konijn en anti-geit 680.). Beschermen tegen licht door incubatie in een niet-transparante container. Gooi de secundaire antilichaamoplossing na 1 uur.
- Was membraan 3 maal met PBS gedurende 5 minuten. Spoel membraan met dH 2 O aan zout te verwijderen.
- Lees de membraan op een infrarood fluorescentie volgens instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We tonen representatieve resultaten van mucine expressie volgende agarosegelelektroforese in BALF van de longen van muizen (figuur 1). In dit voorbeeld hebben we de agarosegel opwaartse regulatie van mucine volgend op IL-13 behandeling van de Tg-MUC5AC muismodel zien. Het Western blot toont een visuele weergave van mucine expressie, die kan worden gebruikt voor een kwantitatieve analyse van multimeer of monomeer band signaalintensiteit (figuur 2). Deze werkwijze kan ook worden gebruikt om expressie van mucinen in humane bronchiale epitheelcellen (HBE) cellen wassingen en humaan sputum monsters tonen. Deze methode kan worden gebruikt voor de reductie van mucinen na behandeling met reductiemiddelen vertonen. We tonen representatieve resultaten van HBE wassingen werden behandeld met toenemende concentraties van DTT (figuur 3). Wij gekwantificeerd verlies van multimeer signaalintensiteit mucine na reductie met behandeling met een reducerend leeftijdnt (Figuur 4).
Figuur 1. opregulatie van mucineproductie Na IL-13 behandeling van de Tg-MUC5AC / Green Fluorescent Protein (GFP) muismodel Muizen overexpressie MUC5AC gelabeld met GFP gedruppeld met PBS. (-) Of IL-13 (+) voor het induceren goblet cel metaplasie en toename mucineproductie in de longen (n = 3 per groep). BALF werden geoogst en gescheiden via agarose mucine Western blotting. Membraan werd gehybridiseerd met een konijn polyklonaal anti-Muc5b (rood) en een geit polyklonaal anti-GFP (groen). De infrarood systeem kan worden gebruikt om de resultaten als een overlay tonen of als een enkel kanaal met de optie om afbeeldingen in zwart-wit te veranderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Kwantitatieve analyse van mucine agarosegel weergegeven opregulatie van mucine secretie van IL-13-behandelde muizen. Muc5b signaalintensiteit gemeten voor elke baan van de gel mucine figuur 1. De resultaten tonen dat mucine secretie verhoogd 5,1-voudig ten opzichte PBS-behandelde muizen-IL-13 behandelde dieren (n = 3, p <0,005). Gegevens getoond als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Vermindering van MUC5AC en MUC5B mucinen in HBE Wassen behandeld met DTT. HBE wasvloeistoffen werden behandeld met 0, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 en 100 mM DTT bij 37 ° C gedurende 30 minutes. Membraan werd onderzocht met een konijn polyklonaal anti-MUC5B (groen) en een muis polyklonaal anti-MUC5AC (rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Kwantitatieve Analyse van Mucine Agarose gel die Verdwijnen van de Multimere Band in HBE Wast Behandeld met DTT. MUC5AC en MUC5B intensiteit van het signaal werd gemeten voor elke rijstrook van de mucine gel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol van mucine Western blotting beschreven in deze video combineert conventionele technieken van moleculaire biologie gescheiden zijn en breng grote macromoleculen, zoals DNA, met regelmatige technieken voor eiwitdetectie, dwz., Immunoblotting. Dezelfde techniek kan worden toegepast op de biologie van complexe glycosaminoglycanen, zoals de afbraak van hoog molecuulgewicht hyaluronzuur 18 bestuderen. Hoewel deze techniek kan worden gebruikt in een groot aantal testen succesvolle agarose Western blotting gebaseerd op een veelheid van stappen die nauwgezet en tijdafhankelijke acties nodig. Om succes te maximaliseren, moet een aantal kritische stappen worden beoordeeld.
Monstervoorbereiding en gel laden zijn kritische stappen voor nauwkeurige resultaten. Mucine-rijke monsters, dwz., Sputa, zijn, door de natuur, aanhanger van experimentele buizen, dwz., Pipet tips, centrifugebuizen, filters. Het gebruik van verdringer pipetten en pre-wetting pipetpunten kan het laden van visco-elastisch materiaal in de putjes te vergemakkelijken. Deze monsters hebben speciale aandacht nodig als gevolg van verhoogde drijfvermogen en kleverigheid van deze materialen. Geconcentreerde monsters (boven 5 mg / ml) zal slecht migreren door de poriegrootte van een 0,8% agarosegel en kunnen verdere verdunning en / of denaturatie in maximaal 6 M ureum vereist. Echter, voorkomen dat u monsters gedenatureerd guanidiniumchloride (GuHCl) als guanidinium zal neerslaan met SDS. Derhalve monsters opgeslagen GuHCl vereisen een extra dialysestap. Voor niet-polymere toestand studies zullen gedeeltelijke verlichting (0,5 mM DTT gedurende 5 min) sterk verbeteren van de migratie van geconcentreerde monsters (zie figuur 3).
Eiwit transfer naar de nitrocellulose membraan is een belangrijke stap voor dit protocol, en zo niet uitgevoerd met precisie, kan leiden tot een gekleurd membraan, zwak signaal en valse kwantitatieve resultaten. Nitrocellulose membranen zijn kwetsbaar en gemakkelijk besmet enmoet altijd worden behandeld met handschoenen en zorg voor niet-specifieke binding en schade te voorkomen. Plaatsing van de gel op het membraan vereist een nauwkeurige uitlijning om een goede afdichting te genereren en te voorkomen overdrachtsbuffer lekkage, hetgeen zou resulteren in vlekken en de transfer efficiency verminderen. Vorming van bellen tussen de gel en het membraan wordt voorkomen dat eiwit overdracht en moet zorgvuldig worden vermeden.
Optimale immunodetectie voert hoge affiniteit, hoge specificiteit antilichamen tegen het eiwit ruggengraat van het doel mucine. Onlangs, nieuwe immunisatie strategie, antigen ontwerp en screening technologieën leveren tot een grotere succes met de productie van mucine antilichamen en voorzien van nieuwe tools waarmee mucine biologie studeren. Om twee verschillende mucinen op een blot, dwz., En MUC5AC MUC5B detecteren, moeten de twee primaire antilichamen zijn afgeleid van verschillende gastheersoorten, dwz, konijnen en geiten. Ook moet de secundaire antilichamen worden gelabeld met verschillende fluorofoors te detecteren in zowel 700 NM- en 800 nm kanalen.
Relatieve mucine overvloed en mucine grootte kan direct worden gekwantificeerd met imaging software. Fluorescentiesignaal is recht evenredig met de hoeveelheid doel mucine, waardoor kwantificatie van een groot aantal monsters, van laag (bijv., Cellen wast) naar hoog (bijv., Sputum) mucine concentratie. De absolute concentratie mucine vereist de zuivering van mucine normen, die niet in dit protocol werd beschreven als het een lang en moeilijk proces dat Abdullah et al. 19 beschreven. Bovendien agarose Western blotting geeft de mogelijkheid om mucine shift assays de werkwijze van polymerisatie of depolymerisatie bestuderen. Elektroforetische mobiliteit van mucinen afhankelijk van hun polymere staat, dwz., Migratie van grote polymeren vertraagd en kan worden gekwantificeerd met behulp van de beeldverwerkingssoftware. Bijvoorbeeld, reductiemiddelen zal een mobiliteitsplan sh inducerenift van het signaal dat correleert met veranderingen in de biofysische eigenschappen van het slijm. Dergelijke test kan worden gebruikt om mucine multimerisatiewerkwijze 13 onderzoeken maar ook farmacologische middelen gericht op aantasting van het mucine netwerk 11 te testen. Tot slot, mucine agarose Western blotting in combinatie met fluorescentie etikettering onze aanpak aanzienlijk veranderd in mucinen te bestuderen door het produceren van hoge kwalitatieve en kwantitatieve gegevens.
Veel voorkomende problemen met agarose mucine Western blotting kan leiden tot de volgende resultaten: lage signaalintensiteit, achtergrondlawaai en / of het uiterlijk van punctates op het membraan. Verschillende strategieën oplossen kan worden gebruikt om mucine gelbeelden verbeteren. Intensiteit van het signaal kan worden verhoogd door het laden van grotere steekproef volumes en / of het verhogen van de primaire en secundaire antilichaam concentraties. Typisch hoge achtergrondsignaal te wijten aan onvoldoende blokkeren en / of wassingen, die kan worden opgelost door het uitvoeren van langere block/ Was incubaties, alsmede in geoptimaliseerde blokkerende buffers die commercieel verkrijgbaar zijn. Het uiterlijk van punctates kan het resultaat van uitgebreide membraan incubaties bij kamertemperatuur, waarbij bacteriegroei vergemakkelijkt worden. Punctates kan ook worden veroorzaakt door nitrocellulosemembraan schade door DTT weekoplossing (stap 4,1) en kan worden vermeden door spoelen agarosegel grondig vóór de overdracht en / of verlaging DTT concentratie 5 mM.
De belangrijkste beperking van agarose mucine Western blotting is het gebrek aan proteïneladder hoge molecuulgewicht eiwitten en mucine standaarden die mucine absolute kwantificatie belemmert. De meeste van de gepubliceerde mucine uit agarosegels resultaten vergelijkende studies voor de grootte en concentratie. Gelpermeatiechromatografie met lichtverstrooiing gekoppeld brekingsindex is een andere techniek gebruikelijke precieze molecuulgewicht en de concentratie van macromoleculen te bepalen. Deze techniek is duur eennd specificiteit mist voor mucinen derhalve maatregelen andere grote moleculen in de monsters, bijvoorbeeld DNA. Bovendien gelpermeatiechromatografie niet in staat onderscheid te maken tussen types mucine, dwz., MUC5AC versus MUC5B en maatregelen en gemiddelde concentratie en de grootte van het mengsel van mucinen in een gegeven monster.
Andere technieken kunnen worden gebruikt om mucinen inclusief dynamische en multi-angle lichtverstrooiende 1, isopycnische en snelheid-zonale centrifugering 6, elektronenmicroscopie, massaspectrometrie 1,7,8 bestuderen. Echter, met het onderzoek naar nieuwe farmacologische middelen gericht mucine moleculen, is het noodzakelijk om betrouwbare laboratoriumtechnieken om mucine biologie studeren ontwikkelen. Agarose mucine Western blotting is een relatief eenvoudige en goedkope techniek die kan worden gebruikt om belangrijke vragen over mucine processen, bijv., Verandering van mucine lasten, grootte en verhouding. Deze test wordt gebruiktin toekomstige toepassingen drug effectiviteit en toxiciteit te testen op nieuwe moleculen voor het wegwerken aanhanger slijm in in vitro en in vivo modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflict te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25 g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μg |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100 μg |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5 mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
