Method Article

의 하위 유형 캄 필로 박터 jejuni와 SSP. doylei은 질량 분석 기반 PhyloProteomics를 사용하여 분리 (MSPP)

DOI:

10.3791/54165

⸱

October 30th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

In This Article

Summary

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질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)는 캄 필로 박터 jejuni와 SSP의 모음을 입력하는 데 사용되었다. doylei는 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)에 비해 변형 수준에서 분리합니다.

Abstract

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MALDI-TOF MS는 종 및 아종 수준 그러나 심지어 아래 균주 수준에서뿐만 아니라 일부 박테리아를 차별화 할 수있는 가능성을 제공한다. 검출 가능한 바이오 마커의 대립 이온 이성체 분리는 특정 질량 변화 될. 질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)를 참조 균주 염기 서열을 게놈에 비해 분리 특정 질량 변화에서 phyloproteomic 관계의 공제를 허용하는 방식으로 질량 분석 검출 바이오 마커의 질량을 결합하는 새로운 기술이다. 추론 된 아미노산 서열은 MSPP 기반 dendrograms을 계산하는 데 사용된다.

여기서 우리는 캄 필로 박터 jejuni와의 SSP를 입력하여 MSPP의 흐름을 설명합니다. 일곱 균주의 분리 수집을 doylei. 모든 일곱 균주는 유전 적 다양성을 보여 인간의 기원과 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)의했다. MSPP-입력 충분히 자신의 PHY를 반영 일곱 가지 MSPP 시퀀스 유형의 결과logenetic 관계.

C. jejuni와는 SSP. MSPP 방식은 2 ~ 11 kDa의 질량 범위에서 14 개 바이오 마커 이온, 주로 리보솜 단백질을 포함 doylei. MSPP 원칙적으로, 확장 된 질량 범위와 다른 질량 분석 플랫폼에 적용 할 수있다. 따라서,이 기술은 변형 된 미생물 레벨 입력을위한 유용한 도구가 될 가능성이있다.

Introduction

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지난 십년 동안, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 형 질량 분석계 (MALDI-TOF MS)가 임상 미생물학 1,2 미생물 속과 종의 식별을위한 높은 값의 표준 방법으로 진행 하였다. 종 식별은 그대로 세포 또는 세포 용 해물의 작은 단백질 지문의 기록에 기초한다. 일상적인 임상 미생물에서 사용되는 질량 분석 장치의 일반적인 질량 범위는 2-20 kDa 이상이다. 또한, 결과적인 스펙트럼은 다음 종의 균주 및 아종 이하 레벨 3을 구별하는데 사용될 수있다. 초기 선구적인 연구는 캄 필로 박터 jejuni와 4 균주의 특정 하위 그룹, 클로스 트리 디움 디피 5, 살모넬라 엔테 SSP에 대한 특정 바이오 마커 이온을 확인했다. 엔테의 혈청 형 Typhi (6), 황색 포도상 구균 7-9, 및 E12 - scherichia 10 대장균.

대립 유전자 아형에 해당하는 여....

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Protocol

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1. 바이오 안전성 조건을 고려하여 안전한 작업 환경을 준비

  1. 미생물 작업을위한 관련이있는 실험실 및 안전 규정에 익숙해집니다. 대부분의 인간의 병원성 미생물, 바이오 안전성 수준에서 살모넬라 엔테의 혈청 형의 Typhi 등이 조건에 있지만, 일부를 처리 바이오 안전성 레벨을 www.cdc.gov/biosafety에 액세스 할 수있는 각 병원체를 처리 수준 3. 정보를 요구해야합니다.
  2. 에 관계없이 특정 미생물의 생물 학적 분류, 폐기 전에 멸균해야 감염성 폐기물 등의 감염원과 접촉 온 모든 재료를 생각. 유해 물질 및 생물학적 물질에 대한 지역 안전 지침을 존중합니다. 잠재적으로 오염 물질 (생물 학적)의 즉각적이고 적절한 처분이 적절한 용기 사용할 수 있는지 확인합니다.
  3. (즉, 멸균 장치 (접종 루프), 솔루션 및 문화 미디어를 확인한천 플레이트) 세균 배양을 시작하기 전에 사용할 수 있습니다.
  4. 바로 감염성 미생물을 처리 한 후 살균 비누와 따뜻한 물로 손을 씻으십시오.

2. 참조 및 컬렉션 분리 된 균주

  1. 선택하고 하나의 표준 게놈 염기 서열 참조를 취득 이상적 FASTA 형식으로 인코딩 된 프로테옴의 시퀀스와 함께 격리....

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Results

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이전에, 우리는 성공적으로 C.에 대한 MSPP 체계를 확립 jejuni와의 SSP. 13 jejuni와. 여기서, 우리는 C. 형제를 아종하는 방법을 확장하는 목적 jejuni와의 SSP. doylei. 이 특정 설정에서 일곱 C. jejuni와의 SSP. doylei 분리는 / 연구소 미생물학 UGent BCCM / LMG 겐트, 벨기에의 미생물의 벨기에 컬렉션에서 획득 하였다. 우리의 분석에 사용 된 모든 일곱 분리는 인간의 기원이었다. 설사가 기준으로 봉사와 게놈 염기 서열을 변형 ATCC 49349 (8843 LMG)는 원래 2 세의 호주 아이의 대변에서 분리. LMG 9143, LMG 9243 및 LMG 9255 어린이 설사 고통과 벨기에 브뤼셀에 살고의 대변에서 분리; 컬렉션에서 여섯 추가 균주를 사용할 수 있.......

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Discussion

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MSPP 방식의 설립에서 가장 중요한 단계는 바이오 마커 이온 정체성의 명확한 유전 적 결정이다. 그것은 틀림없이 바이오 마커를 식별 할 수 없다면, 이것은 반응식 13에서 제외한다.

C. jejuni와의 SSP. doylei 방식은 14 개 바이오 마커 이온을 포함한다. 이 5 이하 C. 비교입니다 검출 가능한 C. 사이 jejuni와의 SSP. jejuni와 MSPP 방식 (13) 국지적 가장 큰 차이 jejuni와 SSP. jejuni와와 C. jejuni와의 SSP. doylei 바이오 마커는 L31 (-M) 및 L35 (-M) (13)의 경우에는 아미노 - 말단 메티오닌의 번역 후 제거했다.

.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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탁월한 기술 지원을 제공해 주신 Hannah Kleinschmidt에게 감사드립니다. 이 논문은 Deutsche Forschungsgemeinschaft의 오픈 액세스 지원 프로그램과 괴팅겐 게오르그 아우구스트 대학의 출판 기금의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
acetonitrileSigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany34967
Autoflex III TOF/TOF 200 systemBruker Daltonics, 브레멘, 독일GT02554 G201질량분석기
세균 검사 표준 BTSBruker Daltonics, 브레멘, 독일604537
BioTools 3.2 SR1Bruker Daltonics, 브레멘, 독일263564소프트웨어 패키지
Bruker IVD Bakterial Test StandardBruker Daltonics, 브레멘, 독일82901905개의 튜브
캄필로박터 jejuni subsp. doylei isolate 벨기에 미생물 조정 수집/미생물학 연구소 UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG8843ATCC 49349; IMVS 1141년; NCTC 11951년; 균주 093
캄필로박터 jejuni subsp. doylei isolate 벨기에 미생물 공동 수집/미생물학 연구소 UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG9143Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate 벨기에 미생물 조정 수집 / 미생물학 연구소 UGent BCCM / LMG Ghent, BelgiumLMG7790ATCC 49350; CCUG 18265; 카스퍼 71; 경기관총 8219; NCTC 11847
캄필로박터 jejuni subsp. doylei isolate 벨기에 미생물 공동 수집 / 미생물학 연구소 UGent BCCM / LMG Ghent, BelgiumLMG9243Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei< / em> isolate 벨기에 조정 미생물 수집 / 미생물학 연구소 UGent BCCM / LMG Ghent, BelgiumLMG8871NCTC A603 / 87
Campylobacter jejuni < / em> subsp. doylei< / em> isolate 벨기에 조정 미생물 수집 / 미생물학 연구소 UGent BCCM / LMG Ghent, BelgiumLMG9255Goossens B538
Campylobacter jejuni< > subsp. doylei< / em> isolate 벨기에 조정 미생물 수집 / 미생물학 연구소 UGent BCCM / LMG Ghent, BelgiumLMG8870NCTC A613 / 87
Columbia 한천 기지 Merck, 다름슈타트, 독일1.10455 .0500500 g
FlexSeries 1.2 SR1Bruker Daltonics용251419소프트웨어 패키지
탈분된 양 피 Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, GermanySR0051
에탄올Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany02854 Fluka
formic acidSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyF0507
HCCA matrixBruker Daltonics, Bremen, Germany604531
Kimwipes paper tissueKimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany
MALDI Biotyper 2.0Bruker Daltonics, 브레멘, 독일259935소프트웨어 패키지
Mast Cryobank 바이알Mast Diagnostica, Reinfeld, 독일CRYO/B
MSP 96 광택 스틸 타겟Bruker Daltonics, 브레멘, 독일224989
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany51304
재조합 인간 인슐린Sigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyI2643
트리플루오로아세트산Sigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyT6508
물, 분자생물학 등급Sigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyW4502
나침반 Z188956

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O.

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Mass Spectrometry based PhyloProteomicsMALDI TOF MSCampylobacter jejuni ssp doyleiStrain Level TypingBiomarker Ion AnalysisPhyloproteomic RelationsRibosomal ProteinsMatrix Solution PreparationCentrifugation ProtocolMass Spectra Acquisition

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