جيل من التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة التي كتبها فيوجن الجراحي لتطوير الأريمات
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
تعايش التصاقي الجراحي لحيوانين من خلفيات وراثية مختلفة يخلق سيناريو فريدة من نوعها لدراسة الخلية الجوهرية مقابل الأدوار خلية خارجي للجينات مرشحة للاهتمام، والسلوكيات المهاجرة من الخلايا، وإشارات يفرز في إعدادات جينية منفصلة. لأن الحيوانات التعايش الالتصاقي تتقاسم التداول المشترك، سيتم تبادل الدم أو أي عامل المنقولة عن طريق الدم من حيوان واحد مع شريكها والعكس بالعكس. وهكذا، الخلايا وعوامل الجزيئية المستمدة من خلفية وراثية واحدة يمكن دراستها في سياق الخلفية الوراثية الثانية. وقد استخدم تعايش التصاقي فئران بالغة على نطاق واسع لبحوث الشيخوخة والسرطان والسكري، والسمنة، ونمو الدماغ. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمت تعايش التصاقي الأجنة الزرد لدراسة البيولوجيا التطورية تكون الدم. وعلى النقيض من الفئران، وطبيعة شفافة من الأجنة الزرد يسمح للرؤية مباشرة من الخلايا في سياق التعايش الالتصاقي، مما يجعلها وسيلة قوية فريد للتحقيق وآليات undamental الخلوية والجزيئية. فائدة هذه التقنية، ومع ذلك، محدودة بسبب منحنى التعلم حاد لتوليد الأجنة الزرد التعايش الالتصاقي. يوفر هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة حول كيفية دمج جراحيا الأريمات اثنين من الأجنة الزرد من خلفيات وراثية مختلفة للتحقيق في دور الجينات المرشحة للاهتمام. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الأجنة الزرد التعايش الالتصاقي متسامحون إلى الصدمة الحرارية، مما يجعل السيطرة الزمانية في التعبير الجيني ممكن. لا يتطلب هذا الأسلوب المتطور انشاء وله تطبيقات واسعة لدراسة الهجرة الخلية، مواصفات مصير، والتمايز في الجسم الحي أثناء التطور الجنيني.
Introduction
إنشاء الفسيفساء الوراثية (الوهم) بين النوع البري والحيوانات المعدلة وراثيا هو استراتيجية راسخة والكلاسيكية عن التحقيق في خلية الجوهرية مقابل وظائف خلايا خارجي من الجينات المرشحة 1-6. وقد استخدمت على نطاق واسع الأريمة زرع في الزرد لتوليد أجنة خيالية للدراسات خلية الحكم الذاتي 7-9. اعتمادا على الأنسجة من الاهتمام، ومع ذلك، فإنه يمكن أن يكون تحديا لاستهداف متوقع الخلايا المانحة إلى الأنسجة المطلوب (على سبيل المثال، الدم) 1-3، 7-9. وقد استخدمت الوراثة الماوس طويلة الأساليب الجراحية التعايش الالتصاقي لتوليد الكائنات الملتصقة مع تداول المشتركة 10-14. لأن الحيوانات التعايش الالتصاقي تشترك في مجرى الدم المشترك، والتفاعلات بين الخلايا التي نشأت من حيوان واحد مع خلايا حيوان آخر من خلفية وراثية مختلفة يمكن دراستها 10-16. مؤخرا، أظهرت مجموعة كريمة كيسا بأناقة القدرة على لجنة المساواة العرقيةأكل الأجنة الزرد الملتصقة ومن ثم استخدام هذا النظام لدراسة الجذعية المكونة للدم والخلايا الاصلية (HSPC) الهجرة (15). وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام تعايش التصاقي الزرد مؤخرا للتحقيق في دور كادهيرين البطانية 5 في الخلايا الجذعية المكونة للدم (شهادة الثانوية العامة) ظهور والهجرة، 16 وإلى دراسة دور الخلايا اللحمية في محراب HSPC خلال تطوير الزرد 17.
على عكس الفئران والأجنة الزرد شفافة وتسمح لرؤية مباشرة من الخلايا خلال تطوير التعايش الالتصاقي، مما يجعل من نظام قوي بشكل فريد. فائدة تعايش التصاقي في الزرد، ومع ذلك، محدودة بسبب منحنى التعلم حاد، وجراحة التعايش الالتصاقي على الأجنة حساسة يمكن أن يكون تحديا تقنيا دون تعليمات مفصلة ومظاهرة البصرية. والهدف من هذا البروتوكول هو توفير مجموعة من تعليمات واضحة وخطوة بخطوة لمرافقة الدروس القائم على الفيديو حول كيفية توليد الأجنة الزرد التعايش الالتصاقي لدراسةالزمانية، خلية جوهري، أو وظائف خلايا خارجي من الجين مرشح (ق) عن طريق الانصهار الجراحية تطوير الأريمات. وشملت التعديلات الرئيسية والتوصيات الإضافية لزيادة البقاء على قيد الحياة معايش التصاقي والتطبيقات التجريبية الجديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكان الانصهار التعايش الالتصاقي أداة قوية لتحقيق الوظائف الخلوية من الجينات المرشحة في نماذج الفئران الكبار وافراخ الدجاج 10-14. وفي الآونة الأخيرة، وقد وصفت طريقة الأريمة الانصهار لتوليد الأجنة الزرد الملتصقة 15. في هذا البروتوكول، وتستخدم الدروس القائم …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
