Um método eficiente para obter células de gordura desdiferenciado

Summary

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Abstract

engenharia de tecidos e terapia celular são uma grande promessa clinicamente. A este respeito, as células multipotentes, tais como células estaminais mesenquimais (MSCs), pode ser utilizado terapeuticamente, no futuro próximo, para restaurar a função de órgãos danificados. No entanto, várias questões técnicas, incluindo o procedimento altamente invasivo de isolar MSCs e da ineficiência que cerca sua amplificação, atualmente dificultam o potencial uso clínico dessas modalidades terapêuticas. Aqui, nós apresentamos um método altamente eficiente para a geração de células indiferenciadas de gordura (DFAT), células MSC-like. Curiosamente, as células DFAT podem ser diferenciados em vários tipos de células, incluindo adipogênica, osteogênico, e células condrogênicas. Embora outros grupos apresentaram anteriormente vários métodos para gerar células DFAT a partir de tecido adiposo maduro, nosso método nos permite produzir células DFAT de forma mais eficiente. A este respeito, foi demonstrado que o meio de cultura DFAT (DCM), suplementado com FBS a 20%,é mais eficaz na geração de células DFAT que DMEM, suplementado com 20% FBS. Além disso, as células DFAT produzidos pelo nosso método de cultura de células pode ser redifferentiated em vários tipos de tecidos. Como tal, é apresentado um modelo muito interessante e útil para o estudo de desdiferenciação tecido.

Introduction

A terapia celular e engenharia de tecidos são tópicos quentes no campo da medicina regenerativa ^1-5. Embora essas modalidades terapêuticas são uma grande promessa, várias questões técnicas actualmente dificultam a sua utilização clínica. A este respeito, como na geração de células iPS, todas as terapias de engenharia de tecidos devem produzir células livres de transduções de genes externos, a fim de manter a segurança do paciente. Dessa forma, foram o primeiro grupo a produzir com sucesso células DFAT humanos ^6. Vários outros grupos de pesquisa têm uma vez adoptada nosso método para gerar células de origem em mamíferos DFAT ^7-9, destacando ainda mais a utilidade do nosso modelo.

Ao longo de vários estudos, verificou-se que a qualidade do ambiente de cultura de células podem ser modificadas por ajustamento do teor do meio celular. Esta descoberta conduziu a um aumento na taxa de sucesso da produção de células DFAT e melhoria da qualidade de células; ambos os fatores críticos paraeficiente geração de células para futuros ensaios clínicos. A este respeito, um melhor meio de cultura DFAT (DCM, um produto semelhante a CTM a forma de células, que contém a insulina recombinante humana, albumina de soro, ácido L-glutâmico, vários ácidos gordos, e colesterol) e um método para a geração de células DFAT e proliferação foi desenvolvido (mais informações sobre o conteúdo do DCM está disponível mediante solicitação). Usando este método de elevada qualidade DFAT células foram gerados com a capacidade de se diferenciar em vários tipos de células, incluindo adipogênica, osteogénica, e as células condrogénicas. Ao todo, este protocolo de cultura celular validado melhora a qualidade das células DFAT e pode ser bastante útil para melhorar aplicações clínicas de terapia celular e engenharia de tecidos.

Protocol

As amostras de gordura subcutânea humana foram obtidos de pacientes submetidos à cirurgia nos Departamentos de Cirurgia Plástica, Urologia, Cirurgia Pediátrica e Cirurgia Ortopédica da Universidade Nihon Itabashi Hospital (Tóquio, Japão). Os pacientes deram consentimento informado por escrito, e do Comité de Nihon University School of Medicine de Ética aprovou o estudo. 1. Preparação do Tecido Traga a amostra de tecido da sala de operações para o laboratório. <l…

Representative Results

Neste estudo, o método e o kit de ferramentas para a geração de célula DFAT foi melhorada (Figura 1). O nosso método permite gerar células DFAT usando tanto DCM e meio DMEM contendo 20% de FBS (Figura 2A). Como tal, comparou-se a eficiência de DCM e DMEM na geração de células DFAT. A este respeito, o DCM promoveu a proliferação de células DFAT por três vezes quando comparado com DMEM, independentemente do número de adipócitos <stron…

Discussion

Adipócitos maduros que passam na desdiferenciação vitro, um processo conhecido como cultura de teto, pode reverter para um fenótipo mais primitivo e ganhar habilidades proliferativa. Estas células são referidas como células de gordura (desdiferenciado DFAT). foi avaliado o potencial de diferenciação das células multilinhagens DFAT. A análise de citometria de fluxo e análise da expressão de genes revelaram que as células DFAT eram altamente homogénea em comparação com ⁶ ASC. …

Materials

CSTI303-MSC medium	CSTI	87-671	This medium is defined as DCM in the text
PBS(-)	Wako	166-23555	It does not contain Mg2+ and Ca2+
DMEM medium	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012
Collagenase type II	Sigma	C-6885
Scissors	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Shaker	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100um Yellow	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12.5cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap	CORNING LIFE SCIENCES	353107
18G needle	NIPRO	02-002
20ml Syringe	NIPRO	08-753
Z Series Coulter Counter	BECKMAN COULTER	383550