Den Dimethylnitrosamine indusert leverfibrose Model i Rat
Summary
We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.
Abstract
Fire til seks uker gamle, ble Wistar-hannrotter anvendt for å produsere dyremodeller av leverfibrose. Prosessen krever fire ukers behandling med 10 mg / kg dimethylnitrosamine (DMN), gitt intraperitonealt i tre dager per uke. Intraperitoneale injeksjoner ble utført i avtrekksskap som DMN er en kjent hepatoxin og kreftfremkallende. Modellen har flere fordeler. For det første, kan endringer i lever studeres sekvensielt eller på bestemte stadier av interesse. For det andre kan det stadium av leversykdom bli overvåket ved måling av serum alaninaminotransferase (ALT) og aspartat-aminotransferase (AST) enzymer. For det tredje kan graden av leverskade på forskjellige stadier bli bekreftet ved ofring av dyrene ved angitte tidspunkter, etterfulgt av histologisk undersøkelse av Massons Trichome farget levervev. Etter fire uker med DMN dosering, er den typiske fibrose poengsum 5-6 på Ishak skala. Modellen kan reproduseres konsekvent og har værtmye brukt til å vurdere effekten av potensielle anti-fibrotiske midler.
Introduction
DMN er en potent leverspesifikt toksin. Dens metabolisme, fordeling vev, og evnen til å forårsake skade på leveren hos rotter ble rapportert av Magee 1, og mekanismen for hepatocytter skade og celledød ved apoptose ble beskrevet av Pritchard og Butler 2. Intermitterende administrasjon av denne forbindelsen ble rapportert å indusere leverfibrose hos hunder og rotter 3,4.
Mekanismene og morfologiske forandringer av leverfibrose har blitt grundig undersøkt ved hjelp av denne modellen. I tidlige studier med rotter, 3-ukers behandling med DMN produsert sentrilobulær hemoragisk nekrose etterfulgt av mikronodulær skrumplever uten steatose 5. Det ble vist at i begynnelsen av fibrose, kollagen dannede var mer kryssbundet med type III blir mer fremtredende enn type I-6. I likhet med andre årsaker, ble DMN-indusert fibrotiske forandringer assosiert med en økning i Kupffer celler; levermakrofager som bor in sinusoids. Disse cellene morph inn myofibroblasts og produsere store mengder ekstracellulære matrise som er det primære problemet i fibrose 7.
Når det gjelder cellesignalering, Nakamura et al. Viste at TGF-β spiller en avgjørende rolle i utviklingen av leverfibrose 8. De brukte en adenovirus som uttrykker en avkortet type II TGF-β-reseptoren, spesielt for å inhibere TGF-β signalering. Leverfibrose hos disse rotter ble spectacularly stanset under dmn behandling sammenlignet med kontrollgruppene. Andre studier har bekreftet at undertrykkelse av TGF-β fører til lindring av leverfibrose utvikling 9,10. Modellen ble også brukt i en global gen profilering studie for å identifisere andre fibrose markører og proteiner som kan anvendes som narkotika mål for anti-fibrotiske terapi 11.
Andre kjemiske midler som brukes for å fremkalle leverfibrose omfatte tioacetamid (TAA) og cArbon tetraklorid (CCI4). TAA ble brukt først i rotter og senere i mus 12. Fordelene med denne modellen inkluderer: enkel kjemisk administrering i drikkevann, reproduserbarheten av modellen med karakteristiske mikronodulær cirrhose og biokjemiske forandringer. Ulempene er: den lange periode på 3 måneder for leverfibrose for å utvikle og mangel på forståelse av den molekylære mekanisme for induksjon av leverfibrose. Som for CCI4, har bruken falt av følgende grunner: det ikke etterligne menneskelig leversykdom, har skadelige effekter på ozonlaget, forårsaker smerte og nød til dyr, er svært giftig for mennesker og krever ekstra forholdsregler i sin håndtering og avhending 13,14.
Langvarig gallegang obstruksjon (ved kirurgiske inngrep) som en eksperimentell modell for levercirrhose ble først rapportert av Kountouras et al. 15. Denne metoden er ikke-toksiske for mennesker og dyr. Hsom fører til, varierer den tid som kreves for leverfibrose å utvikle seg. En gjennomgang av 30 rapporter fra Marques et al. 16, fant ut at det tok fra syv dager til fire uker etter operasjonen for leverfibrose å utvikle. De patologiske forandringer beskrevet ligne de av menneskelig kronisk galle fibrose og modellen ville være mer egnet for forskere som er interessert i dette området.
I sammendraget, intermitterende administrasjon av en konstant dose av DMN i rotte over 4 uker produserer leverfibrose som etterligner menneskelig sykdom. Dosert rotter viser progressiv utvikling av leverskade og parenkymatøs fibrose 4,17. Sykdomsprogresjon og alvorlighetsgraden kan overvåkes via blodprøver eller ofring av dyrene på bestemte tidspunkter, og effekten er meget reproduserbar 18. Således modellen har blitt mye brukt for å studere mekanismene for leverfibrose og cirrhose, så vel som for screening av potensielle anti-fibrotiske midler 10,19,20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrevet en metode for å lage en dyremodell av leverfibrose og for å bedømme graden av leverfibrose. Det er viktig å levere riktig dose av DMN og holder seg til planen for ukentlige intraperitoneale injeksjoner. Etter hvert som eksperimentet utvikler seg, er det viktig å veie rottene og beregne en dose ved starten av hver uke av DMN injeksjoner. Husk at DMN er giftig og må håndteres i avtrekksskap på. Vi utfører intraperitoneale injeksjoner i avtrekksskap i tillegg. Med behovet for gjentatte injeksjoner…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the funding support from the Ministry of Education, Singapore, grant number MOE2010-IF-1-025.
Materials
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
References
- Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
- Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).
- Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease. Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).
- Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).
- Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat. J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).
- George, J., Chandrakasan, G. Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen. Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).
- Winwood, P. J., Arthur, M. J. Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease. Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).
- Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).
- Shek, F. W., Benyon, R. C. How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis?. Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).
- Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats. J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).
- Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis. Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).
- Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model. Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).
- Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis. Lab Invest. 53 (2), 166-186 (1985).
- Pritchard, M. T., Apte, U. Models to Study Liver Regeneration. Liver Regeneration. , 15-40 (2015).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Marques, T. G., Chaib, E., et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection. Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).
- Wasser, S., Tan, C. E. Experimental models of hepatic fibrosis in the rat. Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).
- George, J., Chandrakasan, G. Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine. Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).
- Shimizu, I., Ma, Y. R., et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats. Hepatology. 29 (1), 149-160 (1999).
- Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis. J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat. J Vis Exp. (99), (2015).
- Parkinson, C. M., O’Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Ishak, K., Baptista, A., et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).
- Sant’Anna, L. B., Sant’Anna, N., Parolini, O. Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model. J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).
