VacuSIP, एक बेहतर INEX विधि के लिए<em> बगल में</em> पार्टिकुलेट के मापन और भंग यौगिकों सक्रिय सस्पेंशन भक्षण द्वारा प्रसंस्कृत
Summary
We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.
Abstract
Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.
Introduction
Benthic निलंबन फीडरों समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों 1 के कामकाज में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। पानी 2,3 की बड़ी मात्रा में छान कर, वे हटाने और उगलना कण (प्लवक और कतरे) और भंग यौगिकों 1 (और संदर्भ उसमें) और benthic-pelagic युग्मन 4,5 और पोषक तत्व सायकलिंग 6.7 का एक महत्वपूर्ण एजेंट हैं। सही कण और भंग यौगिकों हटा दिया है और benthic निलंबन भक्षण (जैसे स्पंज, ascidians, polychaetes, और bivalves के रूप में) द्वारा उत्सर्जित मापने उनके शरीर क्रिया विज्ञान, चयापचय, और पारिस्थितिकी खिला समझने के लिए मौलिक है। साथ में दर माप पंप के साथ, यह भी इन जीवों और पानी की गुणवत्ता पर और साथ ही पारिस्थितिकी तंत्र पैमाने प्रक्रियाओं पर उनके पारिस्थितिक प्रभाव द्वारा मध्यस्थता पोषक तत्व अपशिष्टों की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है।
कण को हटाने और उत्पादन दर और भंग कॉम को मापने के लिए उपयुक्त विधि का चयनपौंड निलंबन फिल्टर भक्षण द्वारा विश्वसनीय उनके खिला गतिविधि 8 के विषय में डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। जैसा कि Riisgård और दूसरों को, अनुचित तरीके पूर्वाग्रह परिणामों से बाहर बताया है, प्रयोगात्मक शर्तों बिगाड़ना, घूस और कुछ पदार्थों के उत्सर्जन के गलत अनुमानों उपज है, और इन जीवों द्वारा संसाधित पोषक तत्व अपशिष्टों की गलत मात्रा का ठहराव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
दो सबसे अक्सर नियोजित तरीके फिल्टर भक्षण में कण और भंग पोषक तत्व अपशिष्टों को मापने के लिए या तो ऊष्मायन (अप्रत्यक्ष तकनीक) या परिवेश के एक साथ संग्रह और exhaled पानी (प्रत्यक्ष तकनीक) शामिल है। ऊष्मायन तकनीक कण की एकाग्रता और incubated पानी में भंग पोषक तत्वों में परिवर्तन की दर को मापने, और आकलन के उत्पादन या हटाने की दर पर्याप्त नियंत्रण 8 की तुलना के आधार पर कर रहे हैं। हालांकि, एक ऊष्मायन कक्ष में एक जीव संलग्न अपनी Feedin बदल सकते हैंजी और प्राकृतिक प्रवाह शासन में परिवर्तन के कारण व्यवहार पंप, और / या भोजन एकाग्रता में, या ऊष्मायन पानी 7,9 में उत्सर्जन यौगिकों (और संदर्भ उसमें) के संचय के कारण ऑक्सीजन में गिरावट की वजह से। प्रसूति और संशोधित पानी की आपूर्ति के प्रभाव के अलावा, ऊष्मायन तकनीक का एक प्रमुख पूर्वाग्रह फिर से छानने का प्रभाव (उदाहरण के लिए 10 देखें) से उपजा है। हालांकि इन methodological समस्याओं में से कुछ सही मात्रा और ऊष्मायन पोत 11 के आकार का या सीटू 12 में एक recirculating बेल-जार प्रणाली की शुरूआत के साथ दूर किया गया है, इस तकनीक को अक्सर हटाने और उत्पादन दर underestimates। इस तरह भंग कार्बनिक नाइट्रोजन (डॉन) और कार्बन (डॉक्टर) या अकार्बनिक पोषक तत्वों के रूप में भंग यौगिकों के चयापचय को बढ़ाता है, खासकर ऊष्मायन तकनीक की वजह से 13 पूर्वाग्रहों से ग्रस्त हो सिद्ध किया है।
देर से 60 है और जल्दी 70, हेनरी Reiswig में9,14,15, विशाल कैरेबियन स्पंज से कण को हटाने यों के लिए अलग से पानी साँस और बगल में जीवों द्वारा exhaled नमूने द्वारा प्रत्यक्ष तकनीक के इस्तेमाल का बीड़ा उठाया है। कठिनाई छोटे निलंबन फीडरों पर और अधिक चुनौतीपूर्ण पानी के नीचे की स्थिति में Reiswig की तकनीक को लागू करने के लिए कारण, इस क्षेत्र में अनुसंधान के थोक प्रयोगशाला (इन विट्रो में) के लिए प्रतिबंधित किया गया था ज्यादातर अप्रत्यक्ष ऊष्मायन तकनीकों 16 काम करते हैं। Yahel और उनके सहयोगियों Reiswig के प्रत्यक्ष तब्दील सीटू तकनीक में छोटे पैमाने की स्थिति में काम करने के लिए। उनकी पद्धति, करार दिया INEX 16, पानी साँस (में) और exhaled (पूर्व) अबाधित जीवों द्वारा की एक साथ पानी के नीचे नमूने पर आधारित है। (INEX) नमूने की एक जोड़ी के बीच एक पदार्थ (जैसे, बैक्टीरिया) के विभिन्न एकाग्रता जानवर द्वारा कि पदार्थ की अवधारण (या उत्पादन) का एक उपाय है। INEX तकनीक ओपन एंडेड नलियों को रोजगार औरexcurrent जेट का अध्ययन जीव के पंप गतिविधि के द्वारा उत्पादित निष्क्रिय ट्यूब का संग्रह में परिवेश पानी की जगह पर निर्भर करता है। Yahel और उनके सहयोगियों को सफलतापूर्वक 15 से अधिक विभिन्न निलंबन के अध्ययन में इस तकनीक को लागू किया है, वहीं taxa भक्षण (जैसे, 17), विधि, अभ्यास और अनुभव के उच्च स्तर की आवश्यकता से विवश है कुछ excurrent orifices के मामूली आकार के द्वारा, और समुद्र की स्थिति।
इन बाधाओं को दूर करने के लिए, हम मिनट ट्यूब के माध्यम से जांचा पानी की नियंत्रित सक्शन (बाहरी व्यास <1.6 मिमी) पर आधारित एक वैकल्पिक तकनीक विकसित की है। हमारा लक्ष्य एक सरल, विश्वसनीय, और सस्ता उपकरण है कि इस तरह के benthic निलंबन फीडरों की excurrent छिद्र के रूप में साफ और एक बहुत ही विशिष्ट बिंदु से सीटू के पानी के नमूने में नियंत्रित की अनुमति होगी बना रहा था। प्रभावी हो, विधि के रूप में तो परिवेश के प्रवाह शासन को प्रभावित या बी को संशोधित करने के लिए नहीं दखलंदाजी हो गया हैअध्ययन जीवों की ehavior। यहाँ प्रस्तुत डिवाइस VacuSIP करार दिया है। यह Yahel एट अल द्वारा विकसित एसआईपी प्रणाली का सरलीकरण है। (2007) गहरे समुद्र में आरओवी आधारित बिंदु नमूना लेने के लिए 18। VacuSIP काफी मूल एसआईपी की तुलना में सस्ता है और इसके लिए स्कूबा आधारित काम अनुकूलित किया गया है। प्रणाली प्रयोगशाला सेटिंग्स के लिए प्रस्तुत किया और राइट और स्टीफंस (1978) 19 और Møhlenberg और Riisgård (1978) 20 से परीक्षण सिद्धांतों के अनुसार डिजाइन किया गया था।
हालांकि VacuSIP प्रणाली benthic निलंबन फीडरों के चयापचय के सीटू के अध्ययन में के लिए डिजाइन किया गया था, यह भी प्रयोगशाला अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और जहाँ भी एक नियंत्रित और स्वच्छ, बिंदु स्रोत पानी के नमूने की आवश्यकता है। प्रणाली विशेष रूप से उपयोगी है जब लंबी अवधि (न्यूनतम घंटे) या सीटू filtrations में खत्म हो एकीकरण आवश्यक हैं। VacuSIP 2011 के बाद से Yahel प्रयोगशाला में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, और भी हैकैरेबियन और भूमध्य स्पंज प्रजातियों 21 द्वारा मध्यस्थता पोषक तत्व अपशिष्टों के दो हाल के अध्ययनों में नियोजित किया गया (MORGANTI एट अल। प्रस्तुत)।
विशिष्ट samplers, लंबे समय तक नमूना अवधि, और क्षेत्र की स्थिति है, जिसमें VacuSIP लागू किया जाता है, का उपयोग करते हैं, इकट्ठा करने को छानने, और संवेदनशील analytes के लिए नमूने के भंडारण के लिए मानक समुद्र विज्ञान प्रोटोकॉल से कुछ विचलन करना पड़ेगा। VacuSIP प्रणाली या संग्रह के बाद बैक्टीरियल गतिविधि के द्वारा जांचा पानी के संशोधन के जोखिम से संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए, हम सीटू निस्पंदन और भंडारण की प्रक्रिया में विभिन्न परीक्षण किया। विभिन्न छानने उपकरणों, संग्रह वाहिकाओं, और भंडारण प्रक्रियाओं आदेश भंग अकार्बनिक (पीओ 4 3, सं एक्स -, एनएच 4 +, Sio 4) के विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त तकनीक हासिल करने के लिए जांच की गई और कार्बनिक (डॉक्टर + डॉन) यौगिकों, और अल्ट्रा प्लवक (<1081, एम) और कण जैविक (पीओसी + PON) नमूना। इसके अलावा, संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए विशेष रूप से क्षेत्र की स्थिति के तहत, हैंडलिंग कदम की संख्या नंगे न्यूनतम करने के लिए कम हो गया था। जिसमें विधि प्रस्तुत किया है दृश्य प्रारूप reproducibility की सुविधा के लिए और समय कुशलता तकनीक को लागू करने के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए उन्मुख है।
सिस्टम सारांश
2 मिमी के रूप में छोटे exhalant orifices के साथ निलंबन फीडरों से सीटू पंप पानी में नमूने के लिए, प्रत्येक नमूना के पंप गतिविधि पहले inhalant छिद्र (एस) और excurrent एपर्चर 16 से उसके प्रवाह को देख करने के लिए अगले फ़िल्टर fluorescein रंगे समुद्री जल को रिहा द्वारा कल्पना है (देखें भी 18 में 2 बी आंकड़ा)। पानी साँस और अध्ययन नमूना (incurrent और excurrent) द्वारा exhaled फिर एक साथ मिनट नलियों कस्टम निर्मित जोड़तोड़ पर स्थापित की एक जोड़ी के उपयोग के साथ या "एआर में से दो पर जांचा जाता हैएक ऊपर से नीचे लचीला पोर्टेबल तिपाई के एमएस "(चित्रा 1 और पूरक वीडियो 1)। पानी अध्ययन जीव द्वारा साँस ध्यान से एक ट्यूब के समीपस्थ अंत स्थिति के अंदर या अध्ययन जीव की inhalant एपर्चर के पास से एकत्र किया जाता है। एक समान ट्यूब तो excurrent छिद्र के अंदर तैनात है। इस आपरेशन के संपर्क या जानवर की अशांति, जैसे, तलछट मेजबान से बचने के लिए अच्छी तरह से देखभाल की आवश्यकता है। नमूने शुरू करने के लिए, एक गोताखोर एक सिरिंज से जुड़ी सुई के साथ इकट्ठा करने के बर्तन में एक पट pierces प्रत्येक ट्यूब के बाहर का अंत, नमूना ट्यूब के माध्यम से बर्तन में पानी जांचा मजबूर करने के लिए बाहरी पानी के दबाव की इजाजत दी। सक्शन पहले शीशियों में बनाया वैक्यूम द्वारा और बाहरी पानी और खाली करा लिया नमूना कंटेनर के बीच अंतर दबाव द्वारा शुरू की है ।
exhaled पानी की एक साफ संग्रह सुनिश्चित करने के लिए और महत्वाकांक्षी का आकस्मिक सक्शन से बचने के लिएईएनटी पानी 16, पानी नमूना दर काफी कम दर (<10%) excurrent प्रवाह की दर की तुलना में रखा जाना चाहिए। सक्शन दर ट्यूब की लंबाई और इसकी आंतरिक व्यास (आईडी) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। छोटे आंतरिक व्यास भी एक नगण्य मृत मात्रा (<ट्यूबिंग का मीटर प्रति 200 μl) सुनिश्चित करता है। लंबी अवधि (घंटे मिनट) पर नमूना यह संभव ब्याज की सबसे पदार्थों के निहित patchiness एकीकृत करने के लिए बनाता है। यह सुनिश्चित करें कि नमूने लिए पर्याप्त रूप से लंबे समय तक पानी के नीचे नमूना सत्र में और साथ ही परिवहन के लिए प्रयोगशाला में, संरक्षित कर रहे हैं सीटू छानने में एक संवेदनशील analytes के लिए सिफारिश की है। नमूना वाहिकाओं, निस्पंदन विधानसभा, और ट्यूबिंग के चयन के अध्ययन जीवों और विशिष्ट अनुसंधान सवाल से निर्धारित होते हैं। प्रोटोकॉल नीचे वर्णित मान लिया गया है कि एक पूर्ण चयापचय प्रोफ़ाइल (एक सिंहावलोकन के लिए देखें चित्र 2) ब्याज की है। हालांकि, प्रोटोकॉल की मॉड्यूलर प्रकृति च की अनुमति देता हैया आसान संशोधन सरल या यहां तक कि बहुत अलग नमूना योजनाओं को समायोजित करने के लिए। एक पूर्ण चयापचय प्रोफाइल के लिए, नमूने प्रोटोकॉल के बाद के चरणों को शामिल करना चाहिए: (1) फ्लो दृश्य; (2) सैम्पलिंग अल्ट्रा प्लवक खिला (प्लवक <10 माइक्रोन); (3) अकार्बनिक पोषक तत्वों तेज और उत्सर्जन नमूना (में लाइन फिल्टर का उपयोग); (4) सैम्पलिंग जैविक तेज और उत्सर्जन भंग (में लाइन फिल्टर का उपयोग); (5) पार्टिकुलेट खिला और उत्सर्जन (में लाइन फिल्टर का उपयोग); (6) दोहराएँ चरण 2 (गुणवत्ता की जांच के रूप में अति प्लवक खिला); (7) दृश्य प्रवाह।
जब logistically संभव है, यह सिफारिश की है कि चयापचय प्रोफ़ाइल माप दर पंप के साथ संयुक्त कर रहे हैं (जैसे, डाई सामने गति विधि, 16 में) और साथ ही श्वसन माप के साथ। इन मापों अच्छी शुरुआत है और नमूना सत्र के अंत में लिया जाता है। श्वसन माप के लिए, पानी के नीचे optodes या सूक्ष्म इलेक्ट्रोड बेहतर कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
तैयारी के चरण
डोम और पोषक तत्वों के विश्लेषण के लिए कलेक्टर शीशियों
कलेक्टर वाहिकाओं भंग सूक्ष्म घटकों के साथ बातचीत कर सकते हैं और पारखी दीवारों बैक्टीरिया विक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम म में उसकी सहायता के लिए Manel बोलिवार धन्यवाद। हम अपने अनुसंधान और नमूना अनुमति के लिए उनके समर्थन के लिए "Parc प्राकृतिक डेल Montgri, लेस Illes मेदी मैं अल बैक्स टेर" करने के लिए आभारी हैं। पानी के नीचे जोड़तोड़ Ayelet Dadon-Pilosof द्वारा डिजाइन और श्री Pilosof द्वारा निर्मित किया गया था। इस काम स्पेनिश सरकार परियोजना सीएसआई-कोरल [अनुदान संख्या CGL2013-43106-आर आर सी और एमआर करने के लिए] द्वारा और "Ministerio de Educación, Cultura y DEPORTE (MECD)" टीएम करने से एक FPU फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। इस समुद्री biogeochemistry से एक योगदान और वैश्विक अनुसंधान बदलें समूह कैटलन सरकार [अनुदान संख्या 2014SGR1029] और ISF अनुदान 1280-1213 और बीएसएफ अनुदान 2012089 जी Yahel द्वारा वित्त पोषित है।
Materials
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (250µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA VIALS | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09) |
| HDPE VIALS | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42) |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter, pore size 0.7µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 2000 Solution | Decon Labs | E123FH | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7mm x 30mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 |
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