A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.
Genera pollinatorer som buff-tailed humlen, Bombus terrestris, møter både næringsstoffer og giftstoffer i floral nectar de samler inn fra blomstrende planter. Bare noen få studier har beskrevet smaks svarene av bier mot giftstoffer i mat, og disse forsøkene har i hovedsak brukt snabel forlengelse respons på behersket honningbier. Her er en ny atferdsanalyse presenteres for måling fôring svarene av fritt-bevegelse, enkelte arbeidstaker humler til næringsstoffer og giftstoffer. Denne analysen måler mengden av løsning inntas av hver humlen og identifiserer hvordan tastants i mat påvirker mikro fôring atferd.
Løsningene er presentert i en microcapillary rør til individuelle humler som tidligere har blitt sultet for 2-4 timer. Oppførselen er fanget på digital video. Den fine struktur av forings oppførsel blir analysert ved kontinuerlig å utføre plasseringen av ProboSCIS (munndeler) fra videoopptak ved hjelp av hendelseslogging programvare. Stillingen av proboscis er definert ved tre forskjellige adferds kategorier: (1) snabel er utvidet og i kontakt med oppløsningen, er (2) snabel utvidet, men ikke i kontakt med løsningen og (3) snabel er anbrakt under hodet. Videre er hastigheten av proboscis trekke tilbake bort fra løsningen blir også beregnet.
I den foreliggende analyse volumet av oppløsningen forbrukes, antall mater anfall, er varigheten av mate anfall og hastigheten på snabel tilbaketrekkings etter den første kontakt som brukes til å evaluere phagostimulatory eller den avskrekkende virkning av forbindelsene som ble testet.
Denne nye smak analysen vil tillate forskere å måle hvor forbindelser som finnes i nektar påvirke foringsadferden av bier og vil også være nyttig å pollinering biologer, toksikologer og neuroethologists studerer humlen smak system.
Plant-pollinator interaksjoner er komplekse. Pollinatorer besøke blomster for å få nektar og pollen som mat; i sin tur, pollinatorer lette seksuell reproduksjon i planter. Selv om dette forholdet er stort sett mutualistic, floral nektar og pollen noen ganger inneholder giftstoffer eller annen plante forbindelser 1-5 som kan skade pollinatorer. Den økologiske begrunnelsen for tilstedeværelsen av slike forbindelser i nektar og pollen er ikke klart i alle innstillinger. En enestående spørsmålet i dette feltet er hvordan pollinatorer som bier kan oppdage og unngå blomster med nektar inneholder giftstoffer.
Humlen arter, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), er en generalist pollinator som besøker blomster av mange plantearter, inkludert de som produserer nektar inneholder giftstoffer 6. Biene er blitt vist å unngå forbruk av oppløsninger inneholdende høye konsentrasjoner av giftstoffer i en 24-timers to-valg assay 7. denne analysenav matforbruket beskrevet av Tiedeken et al. 7 viser at biene kan oppdage bitre forbindelser løsninger. Men denne analysen var ute av stand til å skille smak fra post-ingestive prosesser som ubehag som også kan påvirke mating oppførsel i løpet av dette tidsintervallet 8-10.
Bees har smaks sensilla på sine antenner, munndeler og tarsi å oppdage forbindelser 11-13. Den snabel forlengelse refleks (PER) eksperimenter innebærer å dempe enkelte bier i en sele og deretter stimulere bee antennal sensilla å produsere fôring refleks 14-17. Bier kan holdes tilbake i enkeltrammer og deretter stimuleres til å produsere mate refleks som en undersøkelse av deres evne til å smake forbindelser 18,19. Andre har endret per test for å undersøke følsomheten av antennene eller munndeler for å toksiner 9,20. Imidlertid er bier utsettes for stress under utnytte. Dette kan påvirke hvordande reagerer på forbindelser 21.
Her er en ny analyse beskrevet å vurdere atferds smak responsen av fritt bevegelige humler til sukrose og kinin, et alkaloid som tidligere har blitt rapportert å være avskrekkende 9 og giftig 10 til honningbier (Apis mellifera) og humler (Bombus terrestris) 7, 22. Selv om kinin ikke har blitt funnet i anlegget nektar, denne alkaloid ofte brukt som en motvilje stimulans i atferdsmessige og fysiologiske studier i bier 7,9,12,13,22. Metoden innebærer videoopptak humlene 'munn i stor oppløsning under den første snabel kontakt med testløsninger. Nærmere bestemt er den fine strukturen til mate respons undersøkt ved kontinuerlig å utføre atferd over en 2 min intervall. Volumet av oppløsningen som forbrukes måles i løpet av foringsperioden, og slik at mengden av mat som spises kan korreleres med mikrofôring atferd. Også hastigheten på snabel tilbaketrekkingen blir målt, som en indikator på en aktiv unngåelse, og derfor forhånds ingestive deteksjon.
Med denne romanen atferdsanalyse, er kinin vist seg å avskrekke fôring av buff-tailed humlen. Den reduserte snabel kontakttid og fôring bout frekvens med vann eller sukrose løsning fylt med kinin tolkes her som et avslag å initiere ytterligere fôring på ikke-nærings eller potensielt giftige løsninger. Når kinin tilsettes til en M sukroseløsning, biene ikke bare redusere volumet av oppløsningen de forbruker, har de også trekke tilbake snabel raskere, og dermed redusere kontakttiden mellom munn og oppløsningen som inneholder et toksin. Sammen disse resultatene tyder på at kinin oppfattes av smaks reseptor cellene på munndeler av humlen, som allerede tidligere identifisert i honningbie 9. Kinin er et giftstoff for insekter som induserer utilpasshet-lignende oppførsel i Honey Bee 10 og knockdown i malariamyggen (Anopheles gambiae) 23. Denne analyse kan godt føre til Identifikasion av noen avskrekkende og potensielt giftige forbindelser som oppfattes av smak reseptor cellene på munn i humlene.
Det er avgjørende for den mikrokapillarrør rør som skal fylles med et tilstrekkelig volum av testoppløsningen for å vare i hele testperioden. Det anbefales at minst omkring tre fjerdedeler av microcapillary røret (f.eks 70-80 pl) er fylt. Imidlertid bør man være forsiktig for ikke fullstendig å fylle mikrokapillarrør røret for å redusere risikoen for søl under prosessen med å skanne og å feste mikrokapillarrør røret til den eksperimentelle apparater. Forsiktighet bør også tas når de presenterer 500 mM sukrose dråpe til humlen, slik at eksperimentator unngår lekker dråpe inn holderøret.
4 mm hull ved spissen av holderøret er stor nok for en voksen arbeider humlen til naturlig forlenge dets snabel mot prøveløsningen. Men det er mulig atbiene kan smake løsningen med antennene sine før utvide sine proboscises. Dette kan påvirke sannsynligheten for snabel forlengelse som PER kan oppnås hos biene ved å stimulere sine antenner med en sukkerløsning 15. Faktisk antennene Hymenoptera som parasittvepser (Trissolcus brochymenae) 24 eller Honey Bee 13 er utstyrt med smak sensilla, som tillater dem å smake sukker og giftstoffer som kinin. Følgelig kunne innledende antennal kontakter med løsninger som inneholder svært avskrekkende forbindelser som kinin også redusere motivasjonen til en humlen til å utvide sin snabel og dermed påvirke den eksperimentelle suksess rate. Selv antennal kontakt med testløsning ikke kan kontrolleres, i denne studien fant vi ikke noen signifikant effekt av antennal kontakt på snabel forlengelse mot testløsning. I denne analysen umiddelbart sette opp microcapillary røret etter pre-testfasen whøne humlene 'antenner er fortsatt innenfor holderøret kan redusere muligheten for humlene å smake test løsning med antennene sine.
Den største begrensningen av denne analysen oppstår når spore snabel tilbaketrekking fra prøveløsningen etter første snabel kontakt ved hjelp av bevegelsessporing video programvare. Videoopptak viser bare 2D bevegelse av snabel, så den gitte produksjonen av hastighetsmåling kan være under eller over estimert. Men med enkelte modifikasjoner, kan dette aspektet av analysen forbedres.
Denne analysen kan brukes til å observere naturlige nærings responser overfor oppløsninger inneholdende forskjellige forbindelser inkludert naturlig-forekommende plante sekundære metabolitter. Observere de umiddelbare fôring svar med denne analysen gir detaljert informasjon om hvordan biene oppdage disse forbindelsene. Dette er en fordel over eksisterende 'go-no go' metoder som PER 18,19 </sup> Og over to valgs analyser 7 fordi denne metoden produserer flere atferdsresponstiltak, herunder matforbruk under en diskret fôring bout.
Måling av flere parametere tillater samtidig en bedre evaluering av smaken av en forbindelse. For eksempel i vår analyse, unngå biene forbruk av vann eller sukrose løsning fylt med kinin. Tilbaketrekking av snabel kan være forårsaket av en endring i svarene til de sukker reseptor celler 12,13. Vår analyse viser at biene trekke snabel raskere etter å kontakte sukrose pluss kinin løsning enn vann alene; Dette kan tyde på at kinin påvirker et distinkt sett av nevroner i tillegg til å hemme sukker sensing nerveceller 9,12,13,25.
Vår analyse tillater analyse av tidsmessige mønster av atferdsmessige responser under fôring. En tilsvarende protokoll der forbruket tid og antall utbrudd måles har alklar iverksatt for å vurdere fôring svar av Drosophila til nærings og uten næringsverdi sukker 26. Vi spår at bier vil vise en mer pålitelig svar på fôring stimulerende midler i vår analyse enn i andre metoder som PER fordi biene er fri til å bevege seg i holderøret 21. Denne teknikken vil tillate en uttømmende analyse av smaks terskler for næringsstoffer og giftstoffer for å belyse mekanismene av fôring i humler og potensielt andre bee arter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Leverhulme Trust stipend (RPG-2012-708) og en BBSRC stipend (BB / M00709X / 1) for å GAW.
Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
Male luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
ImageJ software version 1.48 | ImageJ |