توصيف وظيفي من الضامة التنظيمية التي تمنع مناعة الكسب غير المشروع
Summary
الضامة هي خلايا بلاستيكية من نظام المكونة للدم التي لها دور حاسم في مناعة وقائية والتوازن. في هذا التقرير، وصفنا الأمثل في تقنيات المختبر إلى ظاهريا ووظيفيا تميز الضامة التنظيمية المتسلل الكسب غير المشروع التي تتراكم في الجهاز المزروع تحت ظروف التحمل.
Abstract
وقد تم الاعتراف منذ فترة طويلة تراكم بلعم في الأعضاء المزروعة سمة من سمات الطعم المغفل الرفض 1 . الحيدات المناعية التسلل في المزروع في وقت مبكر بعد زرع، جبل استجابة الكسب غير المشروع رد الفعل ضد الجهاز المزروع، والشروع في رفض الجهاز 2 . وتشير البيانات الأخيرة أن الضامة قمعية تسهيل نجاح زرع على المدى الطويل 3 وهي مطلوبة لتحريض زرع التسامح 4 . وهذا يوحي بمفهوم متعدد الأبعاد للنسيج البلاعم، والتفعيل، والوظيفة، الأمر الذي يتطلب خارطة طريق جديدة لعزل وتحليل وظيفة البلاعم 5 . بسبب اللدونة من الضامة، فمن الضروري توفير منهجية لعزل وتوصيف الضامة، اعتمادا على بيئة الأنسجة، وتحديد وظائفهم وفقا لسيناريوهات مختلفة. هنا، نحن تصفيكون بروتوكول لتوصيف المناعة من الضامة المتسلل الكسب غير المشروع والطرق التي استخدمناها لتقييم وظيفيا قدرتها على منع انتشار CD8 + T وتعزيز CD4 + Foxp3 + تريج التوسع في المختبر .
Introduction
يصف هذا البروتوكول في تقنيات المختبر لدراسة وظيفة الضامة تسلل الأنسجة معزولة من المغايرة القلب، وفقا لقدرتها على تعديل استجابات الخلايا التائية. وصفت على نطاق واسع في الأدب، والأصباغ تتبع الخلايا الفلورسنت في تركيبة مع التدفق الخلوي، هي أدوات قوية لدراسة وظيفة قمعية من أنواع الخلايا المحددة في المختبر وفي الجسم الحي. بروتوكول لدينا يتبع طريقة إستر سوتسينيميديل كاربوكسيفلورسين (كفس) لرصد انتشار الخلايا الليمفاوية في المختبر .
عندما تنقسم خلية كفس المسمى، نسلها يكتسب نصف عدد من الجزيئات كاربوكسيفلورسين الموسومة 6 . الانخفاض المقابل في مضان الخلية عن طريق التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتقييم انقسام الخلايا، ورصد قدرة الضامة قمعية لتعديل الاستجابات المناعية خلية T. منذ كفس هو صبغة فلوريسئين، وهو متوافق مع برمجموعة أواد من فلوروكروميس أخرى، مما يجعلها قابلة للتطبيق على متعدد الألوان التدفق الخلوي. الاختيار المناسب من فلوروكروميس ل فينوتيبينغ مهم أيضا لتجنب التداخل الطيفي المفرط وعدم القدرة على التعرف على الخلايا المضادة للأجسام المضادة، وخاصة مع مرئية الأصباغ البروتين مثل كفس 7 .
هناك العديد من المزايا من استخدام الأصباغ الفلورية على التقنيات البديلة التي تقيس تكاثر الخلايا، مثل فحص ثيميدين التأسيس، والذي يستخدم ثيميدين راديولبلد (تبر) 8 . هذا الفحص يستخدم ثيميدين تريتيتد ( 3 H-تدر) التي تم دمجها في فروع جديدة من الحمض النووي الكروموسومات خلال انقسام الخلايا الانقسامية. ومن الشواغل المتعلقة بالسلامة المرتبطة بهذا الفحص استخدام النظائر المشعة، حيث يستخدم مقياس بيتا التلألؤ لقياس النشاط الإشعاعي في الحمض النووي المسترجع من الخلايا من أجل تحديد مدى انقسام الخلايا. من الناحية المنهجية، والحمض ثيميدين تريتيتدأي ليست مرنة بما يكفي لتناسب القيود المخبرية السريرية الهامة مثل انخفاض عدد الخلايا وتأخر التحليل بعد تلطيخ. على العكس من ذلك، وقد تبين تلطيخ كفس لمنع تكاثر الخلايا والتدخل مع علامات التنشيط الحرجة، مثل CD69، هلا-در و CD25 9 . لذلك، فهم مزايا وحدود كل منهجية، وخاصة في دراسات متعددة الألوان حيث يتم استخدام الأصباغ متعددة لتتبع أنواع الخلايا المختلفة، أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة في إمونوشاراكتيريز الكسب غير المشروع التسلل مجموعات فرعية النخاعي في نموذج الفئران التجريبية لزرع القلب، والذي ينطبق أيضا على الأنسجة الأخرى في نماذج تجريبية الفئران مختلفة. وكان الفرز المنخفض الضغط الخلية في 20 رطل لكل بوصة مربع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف بالمساهمات التقنية من التدفق الخلوي، الجراحة المجهرية، والمستودع الحيوي / مراكز علم الأمراض التميز البحثي في جبل سيناء. وقد تم دعم هذا العمل من قبل العمل كوست BM1305: العمل على التركيز وتسريع العلاجات المسببة للحساسية الخلية (A فاكت)، وصندوق سيناي ريكاناتي / ميلر زرع النمو صناديق التنمية، وزيرة التنمية سي إنوفاسيون SAF2013-48834-R و SAF2016-80031-R JO
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2’deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), e238 (2007).
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation. Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
